Title
Contents
1\. Introduction 1
1.1. Carbonic Anhydrases 1
1.2. Carbonic Anhydrase IX (MN) 5
1.3. Development of the Mouse Stomach and Architecture of the Gastric Mucosa
13
2\. Aim of the Work 22
3\. Materials 23
4\. Methods 31
4.1. Preparation and Analysis of DNA 31
4.2. Enzymatic Manipulations of Nucleic Acids 38
4.3. Preparation and Analysis of RNA 43
4.4. Analysis of Proteins 49
4.5. Cell Culture Methods, ES Cells Handling and Use 52
4.6. Analysis if Phenotypic Changes in the Mice 60
5\. Results 62
5.1. Isolation and Characterization of Murine MN/CA9 cDNA 62
5.2. Isolation and Characterization of MN/CA9 Gene 70
5.3. Construction of MN/CA9 Deficient Mouse 72
5.4. Analysis of MN/CA9 Deficient Mice 81
5.5. Conclusions 89
6\. Discussion 90
7\. Summary 100
7.1. Summary 100
7.2. Zusammenfassung 102
8\. References 104
9\. Annexe 116Human MN/CA IX protein localized on the surface of epithelial cells is a
member of the carbonic anhydrase family isozymes. Its multidomain composition
implies rather broad functionality. Under normal conditions MN/CA IX is
expressed in several tissues of the alimentary tract, notably in the gastric
mucosa. Furthermore, its aberrant expression has been connected to
carcinogenesis. Recently MN/CA IX protein was linked to the regulation of cell
proliferation and identified as a molecule involved in the cell adhesion.
Despite the increasing knowledge about MN/CA IX protein, its physiological
relevance in the gastrointestinal tract and its role in oncogenesis has not
been understood. In order to assess the function of the MN/CA IX protein in
vivo, mice lacking the MN/CA IX protein were generated by gene targeting. In
order to fulfil this approach, cDNA and genomic DNA, coding for the murine
MN/CA IX protein, had to be identified, isolated and characterized. The murine
counterpart of human MN/CA IX was identified on the basis of its sequence
homology and expression pattern. The full length of the murine MN/CA9 cDNA is
1982bp. The open reading frame of 1311bp has a coding capacity for a 437 amino
acid protein with a theoretical molecular mass of 47,3kDa. The alignment of
the predicted amino acid sequence of the murine and human MN/CA9 cDNAs showed
only 69,5% sequence identity. However, all the extracellular and intracellular
domains were conserved in both. Expression of the murine MN/CA9 mRNA is
highest in mouse stomach, then in the proximal intestine and distal colon. The
MN/CA9 cDNA was also detected in several tumor cell lines (TS/A; GR/3; and
MM5) and one tumor sample. This observation hints at a possible implication of
the MN/CA IX protein in oncogenesis also in mouse. For further investigation
the murine MN/CA IX protein was isolated, purified, and the identity validated
by MALDI-MS. Since the used purification method is applicable only for
enzymatically active carbonic anhydrases, this result at the same time
sustains the conservation of at least some carbonic anhydrase activity of the
murine MN/CA IX protein. The apparent molecular mass of the murine MN/CA IX
was estimated at 54kDa. This result was confirmed by Western blot analysis
with prepared polyclonal rabbit antiserum which was raised against an
oligopeptide from the proteoglycan-like domain. The murine MN/CA9 gene was
isolated from a mouse genomic library. The gene is divided into 11 exons and
10 introns, spanning 6,7kb of the mouse genomic DNA. A comparison of
exon/intron boundaries of the mouse and human genes showed identical gene
structure suggesting their high evolutionary conservation. A replacement type
vector with a targeted interruption of the first exon of the murine MN/CA9
gene was introduced into the mouse embryonic stem cells by homologous
recombination. The mice, homozygous in the MN/CA9 gene mutation, were normal
in terms of size, activity, behavior, ability to reproduce and life span. The
most remarkable changes were found in the gastric mucosa of MN/CA9-/- mice.
Severe hyperplasia in adult mutant mice concerned all major glandular and
superficial epithelial cells. In addition to hyperplastic changes, large
pathological cysts were observed. The first mild changes in the thickness of
the gastric epithelium were detected already in newborn MN/CA9-/- mice.
Immunohistochemical staining for PCNA indicated a massive enlargement and
disorganization of the proliferative zone of the stomach epithelium. A
similarly disorganized pattern was observed by E-cadherin immunostaining of
the gastric mucosa of mutant mice. The ratio of the number of proliferative
cells stained by PCNA and total number of cells in the proliferative area was
approximately the same as in the MN/CA9+/+ mice. Since a defect in the
cellular death was excluded, the alterations in the gastric epithelium are
most likely caused by deregulated cell proliferation. Whether E-cadherin
mediated cell adhesion is affected by the absence of MN/CA IX remains still to
be determined. Although the precise physiological role of the MN/CA IX protein
in the gastrointestinal tract is still not clear, significant insight has been
gained. We propose that the null mutation of MN/CA IX protein perturbs the
process of proper mediation and/or processing of the extracellular signaling
that normally defines the level of the proliferation and maintenance of the
architecture of gastric epithelial cells. Among the carbonic anhydrase
isozymes MN/CA9-/- mice are the first animal model for carbonic anhydrase
deficiency constructed by gene targeting. Moreover, MN/CA IX is the first
targeted adhesion-related molecule expressed in the gastrointestinal
epithelium that revealed involvement in morphogenesis of the mucosa. The
MN/CA9-/- deficient mouse provide an excellent system to elucidate the role of
this molecule in the morphogenesis of the gastric epithelium and its
involvement in carcinogenesis.Das humane MN/CA IX Protein, welches sich auf der Oberfläche von Epithelzellen
befindet, ist ein Mitglied der Familie der Carboanhydraseisozymen. Seine
multidomäne Zusammensetzung deutet auf eine vielseitige Funktion. Unter
normalen Bedingungen wird MN/CA IX in verschiedenen Geweben exprimiert,
hauptsächlich in den Schleimhäuten des Gasterointestaltrakts. Eine gestörte
Expression ist mit Krebsentwicklung in Zusammenhang gebracht worden. MN/CA IX
Protein beeinflusst auch die Regulation der Zellproliferation und der
Zelladhäsion. Obwohl die Erkenntnis über MN/CA9 zunimmt, bleibt seine
physiologische Relevanz im Gastrointestaltrakt und seine Rolle bei der
Krebsentwicklung unverstanden. Um Verständnis für die Funktion des MN/CA IX
Proteins in vivo zu erlangen, wurden Mäuse mit einer Nullmutation im MN/CA9
Gen durch gezielte Mutagenese hergestellt. Vorbereitend wurden die cDNA und
die genomische DNA Sequenzen der Maushomologen isoliert und charaktersisiert.
Das maushomologe MN/CA9 Gen wurde basierend auf DNA Sequenzhomologie und
anhand von Expressionsmustern identifiziert. Die murine cDNA von MN/CA9 ist
1982 Basenpaare lang. Das offene Leseraster besteht aus 1311 Basenpaaren
kodiert ein Protein mit 437 Aminosäuren und einer theoretischen Masse von
47,3kDa. Die Sequenzhomologie der humanen und murinen cDNA Sequenz von MN/CA9
ist nur 69,5%. Alle intra- und extrazellulären Domänen sind jedoch
konserviert. Die Expression der murinen MN/CA9 mRNA ist im Magen am höchsten,
gefolgt vom proximalen und distalen Darm. MN/CA9 cDNA konnte auch in einer
Reihe von Tumorzellinien (TS/A, GR/3 und MM5) und in einer Tumorprobe
nachgewiesen werden. Dies deutet auf eine mögliche Rolle von MN/CA IX Protein
in der Krebsentstehung hin. Zur weiteren Untersuchung wurde das murine MN/CA
IX Protein isoliert, aufgereinigt und seine Identität mit MALDI-MS bestätigt.
Die verwendete Aufreinigungsmethode ermöglicht lediglich die Isolation von
enzymatisch aktiven Carboanhydrasen. Dies bezeugt eine mindestens teilweise
Carboanhydrase-Aktivität der murinen MN/CA IX. Die Masse des isolierten
Proteins wurde mit 54kDa abgeschätzt. Dieses Resultat wurde mit einer
Westernblot Analyse mit polyklonalem Kaninchenantiserum, welches gegen
Oligopeptide aus der proteoglykan-ähnlichen Domäne des murinen MN/CA IX
Protein hergestellt wurde, bestätigt. Das murine MN/CA9 Gen wurde aus einer
murinen genomischen Bibliothek isoliert. Es reicht über 6,7kBasen und ist
aufgeteilt in 11 Exons und 10 Introns. Der Vergleich der Exon/Intron
Abgrenzung des humanen und murinen Gens zeigt die identische Genstruktur, was
auf eine hohe evolutionäre Konservierung hindeutet. Mittels homologer
Rekombination wurde ein Ersatzvektor mit einer Unterbrechung im ersten Exon
des murinen MN/CA9 in embryonale Stammzellen eingeführt. MN/CA9-/- Mäuse waren
normal in Bezug auf Körpergrösse, Aktivität, Verhalten,
Fortpflanzungsfähigkeit und Lebensspanne. Die bemerkenswertesten Unterschiede
wurden in der Magenschleimhaut gefunden. Erwachsene MN/CA9-/- Tiere zeigten
eine ausgeprägte Hyperplasie in Drüsen- und oberflächlichen Epithelzellen.
Grosse pathologische Zysten wurden auch beobachtet. Die ersten Anzeichen der
Verdickung des gastrischen Epithels wurden bereits in Neugeborenen MN/CA9-/-
Mäusen gefunden. Eine immunohistochemische Anfärbung für PNCA zeigte eine
massive Expansion und Desorganisation in der proliferierenden Zone des
Magenepithels. Ein ähnlich unorganisiertes Muster wurde mit E-Cadherin-
Immunoanfärbung des gastrischen Epithels in den mutierten Mäusen gefunden. Das
Verhältnis der Anzahl proliferierender und der Gesamtzahl der Zellen in der
proliferierenden Zone blieb vergleichbar zu MN/CA9+/+ Tieren. Da eine Störung
der Apoptose ausgeschlossen werden konnte, sind die Unterschiede
wahrscheinlich auf eine Störung in der Zellproliferation zurückzuführen. Ob
eine durch E-Cadherin vermittelte Zelladhäsion durch die Abwesenheit von MN/CA
IX beeinflusst wird, muss noch ermittelt werden. Obwohl die genaue
physiologische Rolle von MN/CA IX Protein im Gastrointestaltrakt immer noch
nicht klar ist, sind wesentliche Fortschritte erzielt worden. Wir vermuten,
dass die Nullmutation von MN/CA IX Protein den Prozess der Übermittlung und
Verarbeitung der extrazellulären Signale, der normalerweise den Grad der
Zellproliferation und der Integrität des gastrischen Epithelzellen regelt,
stört. Diese MN/CA9-/- Mäuse sind das erste Tiermodel für ein Carboanhydrase,
das mit gezielter Mutagenese erstellt wurde. MN/CA IX ist das erste
adhäsionsvermittelnde Molekül, welches im Gastrointestaltrakt exprimiert wird
und eine Rolle in der Morphogenese der Magenschleimhaut zeigt. MN/CA9-/- Mäuse
sind ein ausgezeichnetes Tiermodel um die Rolle von MN/CA IX in der
Morphogenese des gastrischen Epithels und seinen Zusammenhang mit der
Krebsentwicklung zu untersuchen
