Dynamiken und Mechanismen der Blut-Hirnschranken-Störung, des Zellschadens und
der Veränderungen der zerebralen Perfusion nach kortikaler Photothrombose
Focal cerebral ischemia is one of the main causes of death and disability
worldwide. An ischemic core and a surrounding dysfunctional region that is
susceptible to cell injury often characterize the lesion. Assessing the
propensity of the peri-ischemic brain to undergo secondary damage,
understanding the underlying mechanisms, and adjusting treatment accordingly
remain clinically unmet challenges. A significant hallmark of the peri-
ischemic brain is a dysfunctional blood–brain barrier (BBB), yet the role of
disturbed vascular permeability in stroke progression and for functional
outcome is largely unclear. Here I describe a longitudinal in vivo
fluorescence imaging approach for the evaluation of cortical perfusion, BBB
dysfunction, free radical formation and cellular injury in the cortical
photothrombosis model in male Sprague Dawley rats. In this model light-
activated (532 nm) Rose Bengal initiates clot formation thereby preventing
sufficient perfusion to the site of illumination. Cerebral perfusion and BBB
permeability were quantified from intra- and extravascular distribution
kinetics of fluorescein sodium salt following its intravenous bolus
application. In parallel, propidium iodide − a membrane integrity marker −
served as a cell damage marker and was compared to staining with annexin V,
which binds to phosphatidylserin following its exposure on the outer leaflet
of the membrane during cellular injury and death. Reactive oxygen and nitrogen
species were visualized using ROSstar 650 and
4-amino-5-methylamino-2’,7’-difluorofluorescein diacetate and reduced using
phenyl-N-t-butylnitrone, L-NGnitroarginine methyl ester and carboxy-PTIO.
Imaging the peri-ischemic area demonstrated propagation and progression of
hypoperfusion, BBB dysfunction and cell damage during the 3 hour monitoring
period following photothrombosis. While hypoperfusion was identified within a
belt of ~400 μm surrounding the ischemic core, blood-brain barrier dysfunction
and cell damage also occurred at greater distances. Nitric oxide formation
most prominently occurred in arterioles, whereas superoxide and hydroxyl
radicals gave a diffuse peri-ischemic parenchymal signal. Inhibiting free
radical signaling significantly reduced progressive cellular damage after
photothrombosis, with no significant effect on blood flow changes and
increases in BBB permeability. Of note, cellular injury was only prevented in
normally perfused more distant peri-ischemic brain regions (> 400 μm away from
the ischemic core). Hence our data is in agreement with previous studies
stressing perfusion based imaging as insufficient to detect tissue at risk.
Measurements of BBB permeability could serve as a novel approach to predict
lesion progression. In addition, our approach allows a dynamic follow-up of
cellular events and their response to therapeutics in the acutely injured
cerebral cortex.Schlaganfall ist weltweit eine der Hauptursachen von Morbidität und
Mortalität. Ein ischämischer Kern und eine weiter gefasste funktionsgestörte
Region, in der es zu sekundärem Zellschaden kommen kann, kennzeichnen dieses
Krankheitsbild. Die Anfälligkeit für sekundären Zellschaden zu erfassen,
zugrunde liegende Mechanismen herauszufinden und Therapien entsprechend
anzupassen, bleiben jedoch Herausforderungen der gegenwärtigen Forschung. Eine
eingeschränkte Blut-Hirn-Schranken-Funktion ist im peri-ischämischen Gewebe
üblich. Es bleibt jedoch weitgehend unklar, inwieweit diese zur Vergrößerung
des Infarktkerns beiträgt und dadurch die klinische Genesung beeinflusst. In
dieser Arbeit beschreibe ich eine longitudinale Methode der in vivo
Fluoreszenzbildgebung zur Evaluierung des zerebralen Blutflusses, der Blut-
Hirn-Schranken- Permeabilität, der Bildung freier Radikale und des Zelltodes
im kortikalen Photothrombosemodell an männlichen Sprague Dawley Ratten. In
diesem Modell führt lichtaktiviertes Bengalrosa zur Thrombusformation und
verhindert so die ausreichende Blutzufuhr in zuvor illuminiertes Gewebe. Die
zerebrale Perfusion und die Blut-Hirn-Schranken-Permeabilität wurden anhand
der intra- und extravaskulären Verteilungskinetik von zuvor intravenös
injiziertem Fluoresceinsalz quantifiziert. Parallel diente Propidiumjodid, ein
Membranintegritätsmarker, als Indikator für Zellschaden. Dieser wurde mit
einem zweiten Marker, Annexin V, verglichen. Annexin V bindet an
Phosphatidylserin, welches bei Zellschaden und -tod vom Zellinneren an die
äußere Lage der Lipiddoppelmembran transloziert wird. Sauerstoff- und
Stickstoffradikale wurden durch die Farbstoffe ROSstar 650 und
4-Amino-5-Methylamino-2’,7’-Difluorofluorescein-Diacetat sichtbar gemacht, und
deren Vorkommen im Gewebe bzw. deren Bildung wurde durch
Phenyl-N-t-butylnitron,L-NG-Nitroargininmethylester und Carboxy-PTIO
reduziert. Das peri-ischämische Gewebe wurde für drei Stunden nach Induktion
der Photothrombose bildgebend überwacht. Innerhalb dieses Zeitraums kam es zu
Propagation und Progression von Hypoperfusion, Blut-Hirn-Schrankenstörung und
Zellschaden. Während hypoperfundiertes Gewebe nur in einem Abstand von ca. 400
μm um den Infarktkern detektiert wurde, war auch weiter entferntes Gewebe von
einer Blut-Hirn-Schranken-Störung und Zellschaden betroffen. Stickstoffmonoxid
stieg am prominentesten in Arteriolen an, während Superoxid- und
Hydroxylradikale ein diffuses parenchymales peri-ischämisches Signal gaben.
Die Blockade freier Radikale reduzierte die Progression von Zellschaden, hatte
jedoch weder Einfluss auf die Perfusion noch auf die Blut-Hirn-Schranken-
Permeabilität. Interessanterweise wurde die Ausbreitung des Zellschadens nur
in normal perfundiertem peri-ischämischem Gewebe (> 400 μm vom Infarktkern
entfernt) reduziert. Damit stimmen die Daten mit solchen Studien überein, die
betonen, dass perfusionsbasierte Bildgebung nur unzureichend erfasst, ob
Gewebe von Sekundärschaden bedroht ist. Messungen der Blut-Hirn-
Schrankenpermeabilität könnten als zusätzlicher neuer Ansatz zur Abschätzung
der Schadensprogression dienen. Die longitudinale Bildgebung, wie hier im
Tiermodell beschrieben, macht es möglich, zelluläre Ereignisse im akut
geschädigten Hirngewebe in ihrer Dynamik zu überwachen und den Effekt
möglicher Therapeutika zu überprüfen
