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Widmung
Publikationshinweise
Inhalt
Verzeichnis der Abkürzungsverzeichnis
Einleitung
Literaturübersicht
Material und Methoden
Ergebnisse
Diskussion
Zusammenfassung
Summary
Abbildungsverzeichnis
Tabellenverzeichnis
Literatur
Danksagung
SelbständigkeitserklärungDie Mitglieder der CLCA-Familie stellen eine neu entdeckte Proteinfamilie dar,
die funk-tionell mit einer Kalzium-aktivierten Chloridleitfähigkeit in
verschiedenen Zelltypen im Zusammenhang steht. Die Vertreter mCLCA3 (Maus) und
eCLCA1 (Pferd) spielen eine besondere Rolle bei Krankheiten mit gestörter
sekretorischer Funktion. Insbesondere ihre Bedeutung bei der
Becherzellmetaplasie, z.B. bei Asthma und chronischer-obstruktiver
Bronchiolitis, ist von hoher biomedizinischer Relevanz. Funktionelle Analysen
im hetero-logen Zellsystem zeigten in früheren Arbeiten, dass diese CLCA-
Proteine eine der jener im Gewebe ähnlichen Chloridleitfähigkeit induzieren,
die durch Kalzium als intrazellulärer Botenstoff gesteuert wird. Unklar war
jedoch bisher, ob die CLCA-Proteine mit Hilfe von Transmembrandomänen einen
eigenständigen Chloridkanal bilden oder ob sie Regulatoren eines anderen,
bislang unbekannten Chloridkanals darstellen. Für die CLCA-Proteine wurde
früher ein Protein-Strukturmodell mit vier oder fünf Transmembrandomänen
erstellt. Ein solcherart strukturiertes Protein könnte die Funktion eines
Kanals erfüllen. In neueren immunhistochemischen und
elektronenimmunhistochemischen Untersuchungen konnte das mCLCA3-Protein jedoch
in der extrazellulären Muzinschicht über den Enterozyten gefunden werden, so
dass mCLCA3 offenbar durchaus zumindest zum Teil von der Zelle abgegeben
werden kann. Diese Arbeit sollte die Fragestellung prüfen, ob mCLCA3 und
eCLCA1 Transmembran-proteine darstellen und so möglicherweise echte Kanäle
ausbilden können, oder aber ob sie sezernierte Proteine sind. Zur Klärung
dieser Frage wurden umfangreiche computergestützte und proteinbiochemische
Untersuchungen durchgeführt. Zuerst wurden mit Hilfe von unter-schiedlichen
Computer-Algorithmen die Aminosäurensequenzen der Proteine nach möglichen
Transmembrandomänen durchgemustert. Unter Anwendung der konfokalen
Fluoreszenz-Mikroskopie wurde mCLCA3 in transfizierten Säugetierzellen
intrazellulär in sekretorischen Vesikeln lokalisiert, eine
Plasmamembranassoziation dagegen war nicht nachweisbar. Nach Expression von
mCLCA3 in Säugerzelllinien wurde in pulse chase-Experimenten die
Transportkinetik von mCLCA3 untersucht und mittels Westernblotanalyse wurde
das Protein näher charakterisiert. Des Weiteren wurde das
Glykosylierungsmuster der Proteine protein-biochemisch bestimmt. Die
Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass die für die CLCA-Proteine
charakteristische Spaltung des Vorläuferproteins für mCLCA3 und eCLCA1 im
endo-plasmatischen Retikulum stattfindet. Die mCLCA3- und eCLCA1-Spaltprodukte
werden vollständig in den extrazellulären Raum als reife Glykoproteine
sezerniert. Aufgrund des Fehlens von Transmembrandomänen können mCLCA3 und
eCLCA1 daher keine eigenständigen Ionenkanäle bilden, somit kann eine echte
Kanalfunktion für diese CLCA-Proteine ausgeschlossen werden. Als sekretorische
Proteine sind sie aber offenbar durchaus in der Lage, indirekt eine
Chloridleitfähigkeit zu induzieren. Außerdem könnten die CLCA-Proteine über
eine Aktivierung von Signalwegen und regulatorischen Mechanismen die für
Atemwegserkrankungen wie Asthma des Menschen und chronisch-obstruktive
Bronchiolitis des Pferdes charakteristische Becherzellmetaplasie hervorrufen.
Zukünftige Arbeiten sollten die Interaktionspartner und Funktionsmechanismen
dieser CLCA-Proteine in Bezug auf die durch sie induzierte Chloridsekretion
als auch auf die Becherzellmetaplasie und Muzin-synthese identifizieren.Members of the CLCA-family represent an emerging protein family and are among
the most promising molecular candidates for the calcium-activated chloride
conductivity observed in several tissues. In particular, the murine mCLCA3 and
the equine eCLCA1 have been identified as clinically relevant molecules in
diseases with secretory dysfunctions. Their induction of goblet cell
metaplasia in diseases like asthma and recurrent airway obstruction is of
particular biomedical relevance. Functional analyses have indicated that these
CLCA-proteins evoke a calcium-activated chloride conductance when
heterologously expressed. However, it is not yet clear whether the CLCA
proteins form chloride channels per se or function as mediators of other, yet
unkown chloride channels. A four or five integral transmembrane model has
initially been proposed for CLCA proteins. Such a protein structure could
potentially form a transmembrane conductive pathway for anions. However,
recent immunohistochemical and immune electron-microscopical analyses detected
the mCLCA3-protein in the extracellular mucous layer, consistent with a
secreted protein. This thesis was designed to address the issue of whether
mCLCA3 und eCLCA1 are integral transmembrane proteins and act as real anion
channels or wether they are secretory proteins. In this study, systematic
computer-based und biochemical analyses were conducted. First, the amino acid
sequences of the two proteins were screened for potential transmembrane
domains using several computer algorithms. Subsequently, confocal microscopy
on mCLCA3-transfected cells revealed that the mCLCA3-protein was
intracellularly localized in secretory vesicles without any association with
the plasma membrane. In addition, the intracellular trafficking was
investigated by pulse chase experiments in transfected and metabolically
labeled mammalian cells. The locations of the proteins were then characterized
by westernblot analyses and the glycosylation patterns of the proteins were
determined. The results show that the characteristic cleavage of the eCLCA1
und mCLCA3 precursor proteins takes place in the endoplasmic reticulum. Both
cleavage products of the mCLCA3-protein are released as glycosylated, mature
proteins into the extracellular space. This was similarly confirmed for the
eCLCA1-protein. Thus, due to the lack of any transmembrane domains, these
proteins are unable to form anion channels on their own. These results
strongly suggest that eCLCA1 und mCLCA3 are secretory glycoproteins rather
than transmembrane molecules. As such they could interact with other chloride
channel proteins to induce the chloride conductivity observed in several
previous experiments. Moreover, they could act as signalling molecules to
evoke goblet cell metaplasia characteristic for complex airway diseases
including asthma and recurrent airway obstructions. Future studies will have
to address the interaction partners and the mechanisms responsible for their
indirect induction of chloride secretion, goblet cell metaplasia and mucin
secretion
