Effects of intra-operative photodynamic therapy with the photosensitizer Mthpc on rabbit large blood vessels, nerves, microcirculation and muscle-tissues.

Abstract

Titelblatt und Inhaltsverzeichnis Einleitung Literaturübersicht Eigene Untersuchungen Ergebnisse Diskussion Zusammenfassung Summary Literaturverzeichnis Anhang Danksagung, LebenslaufDie photodynamische Therapie (PDT) stellt ein neues vielversprechendes Behandlungskonzept in der Tumorbehandlung dar. Dabei wird ein Photosensibilisator intravenös appliziert, der sich verstärkt in Tumorzellen anreichert und durch Licht spezifischer Wellenlängen (Laserlicht) aktiviert wird. Unter Sauerstoffeinfluss entstehen Singulett-Sauerstoff und freie Radikale, die verschiedene Zellbestandteile schädigen und zum Tod der Zellen führen. Diese Behandlung wird bereits in verschiedenen Bereichen der Onkologie erfolgreich eingesetzt. So lassen sich beispielsweise Plattenepithelkarzinome der Haut oder oralen Schleimhäute, Adenokarzinome des Brustgewebes und Tumoren im Urogenitaltrakt zerstören. Durch den intraoperativen Einsatz der photodynamischen Therapie ergänzend zur chirurgischen Tumorresektion sollen verbleibende mikroskopische Tumorreste zerstört und die Gefahr lokoregionärer Rezidive minimiert werden. Besonders im Kopf-Hals-Bereich mit seiner komplexen anatomischen Situation besteht hierbei jedoch die Gefahr, Vitalstrukturen wie große Blutgefäße und Nerven anzugreifen und funktionelle Schäden hervorzurufen. mTHPC ist der am häufigsten verwendete Photosensibilisator für Tumore im Kopf-Hals-Bereich, bisher gibt es jedoch keine detaillierten histologischen Untersuchungen über die Auswirkungen der intraoperativen PDT auf nichtneoplastische Vitalstrukturen. In dieser Arbeit wurden dazu die Effekte der intraoperativen PDT mit dem Photosensibilisator mTHPC auf große Blutgefäße und Nerven sowie die umliegenden Gewebe und die kleineren darin befindlichen Gefäße in der Hals- und Femoralregion klinisch gesunder Kaninchen untersucht. Um die Behandlungsparameter zu finden, die maximale Gewebezerstörungen hervorrufen, wurden Lichtintensitäten (10 bzw. 20 J/cm²) und Behandlungsintervalle (3 Minuten, 6, 24, 48, 72 und 96 Stunden) variiert. Die mTHPC-Dosis betrug kontinuierlich 0,3 mg/kg. Die Gefäße (A. carotis V. jugularis int. resp. A. und V. femoralis) und Nerven (N. vagus resp. N. femoralis) wurden chirurgisch freigelegt und die Bestrahlung erfolgte direkt im offenen Operationssitus. Die Auswirkungen der photodynamischen Therapie auf diese Gefäße, Nerven, die Mikrozirkulation sowie die umliegenden Gewebe wurden histologisch untersucht und bewertet. Zusätzlich wurden fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen durchgeführt, um die Lokalisation des Photosensibilisators im Gewebe 6 Minuten sowie 24 und 72 Stunden nach der Injektion darzustellen. Wir konnten mit der vorliegenden Arbeit zeigen, dass die Vitalstrukturen im Bestrahlungsbereich der photodynamischen Therapie parameterabhängig teilweise erheblichen histopathologischen Veränderungen unterliegen. Wie es für andere Strukturen bereits in der Literatur beschrieben wurde, rufen höhere Lichtintensitäten (20 J/cm²) und kürzere Behandlungsintervalle (24 Stunden gegenüber 96 Stunden) die stärkeren Reaktionen hervor. Das sehr kurze Behandlungsintervall (3 Minuten) hatte dagegen nur minimale Schädigungen zur Folge. Die photodynamischen Effekte auf die untersuchten Arterien (Aa. carotis resp. femoralis) waren Hyperplasie der Endothelzellen bis zur Obliteration des Gefäßes, Bildung von Kopfsteinpflasterendothel, Ablösung des Endothels bei den venösen Gefäßen (Vv. jugularis resp. femoralis) sowie Thrombenbildung. Ein Verschluß der großen Gefäße durch Thrombosierung oder Zellproliferation wurde in sieben Fällen von 148 gefunden, jedoch zeigte keines dieser Tiere entsprechende Krankheitssymptome. Die photodynamische Therapie führte weiterhin zu einer Demyelinisierung der Nv. vagi resp. femoralis. Auch hier waren selbst in Fällen fast kompletter Demyelinisierung keine Lahmheiten zu diagnostizieren. Die bestrahlte Skelettmuskulatur sowie das umliegende Binde- und Fettgewebe unterlagen einer ausgeprägten Nekrose. Es wurden keine allein auf die PDT zurückzuführenden systemischen Nebenwirkungen beobachtet. Vier der insgesamt 42 Tiere litten postoperativ teilweise perakut unter starken respiratorischen Symptomen, die sich trotz Behandlung nicht besserten. Eines dieser Tiere musste deshalb vor Abschluß der Untersuchungen euthanasiert werden, die anderen 3 Tiere verstarben. Diese vier Tiere unterlagen alle der PDT mit den stärksten Behandlungsbedingungen, jedoch sind die Todesfälle nicht in direktem Zusammenhang damit zu sehen. Die vermutlich schon vorher latent vorliegende Erkrankung ist anscheinend durch Operationsstress und/oder die PDT in ein akutes Stadium übergegangen. In mehreren Fällen traten Wundheilungsstörungen z.T. unter Abszedierung auf, diese sind jedoch vermutlich nicht direkte Folge der PDT sondern gehören zu den normalen postoperativen Komplikationen beim Kaninchen. Die Ergebnisse aus den histologischen Untersuchungen standen im Gegensatz zu der Fluoreszenz des Photosensibilisators im Gewebe. Die stärkste Fluoreszenz lag unabhängig von der Zeit im Lumen der Gefäße, z.T. auf Höhe der Endothelzellen, perivaskulär und perimysial vor. Kurz nach der Injektion (6 Minuten) war die absolute Fluoreszenz am größten. Bereits 24 Stunden nach der Injektion war sie insgesamt deutlich geringer und nach 72 Stunden konnte kaum noch Fluoreszenz wahrgenommen werden. Gemäß der Zielsetzung der vorliegenden Arbeit wurde spezielles Augenmerk auf die Auswirkungen der intraoperativen PDT auf die Vitalstrukturen Hauptgefäße und Nerven gelegt. Aus den Ergebnissen dieser Arbeit lässt sich resümieren, dass die intraoperative PDT mit mTHPC behandlungsparameter-abhängig zu teilweise massiven lokalen histologischen Schädigungen der großen Gefäße sowie der Nerven führt. Schwere klinische oder vitale Komplikationen, speziell bezogen auf die Gefäße (Ruptur) und Nerven (Lahmheiten) traten jedoch nicht auf. Die photodynamische Therapie mit dem Phototsensibilisator mTHPC scheint dementsprechend eine vieversprechende und sichere Therapieform zu sein, die die Überlebensrate von Tumorpatienten deutlich erhöhen könnte.Photodynamic therapy (PDT) represents a new encouraging treatment concept in tumour treatment. This treatment modality is based on the intravenous application of a photosensitizing drug that is supposed to accumulate in tumour cells and is activated by light of specific wavelengths (laser light). Under oxygen influence singlet oxygen and free radicals develop which damage different cell components and lead to cell death. This treatment is already used successfully in different fields of oncology. For example, squamous cell carcinomas of the skin or oral cavity, adenocarcinomas of the chest and tumours of the bladder can be destroyed. Intraoperative photodynamic therapy in addition to surgical tumour resection has been proposed to clean the former tumour bed by destroying any remaining tumour cells in order to minimize the danger of local recurrences. Especially in the head and neck area with its complex anatomical situation there is a risk of damaging blood vessels and nerves that are exposed during the treatment which causes functional disorder of these vital structures. Meso(tetrahydroxyphenyl)chlorin (mTHPC) is the mainly used photosensitizer for head and neck cancer but so far there are no detailed investigations to the effect of intraoperative PDT on these vital structures. In this study large blood vessels and nerves at the neck and groin area as well as the surrounding striated muscletissue and the microcirculation of clinically healthy rabbits were treated by intraoperative PDT using the photosensitizer mTHPC. In order to find the treatment parameters, which cause maximum tissue destruction the light intensity (10 J/cm2, 20 J/cm2) and drug- light-interval (3 minutes, 6, 24, 48, 72 and 96 hours) were varied. The mTHPC dose stayed a constant 0,3 mg/kg which was assessed very well in other investigations. After surgical exposion of the large blood vessels (A. carotis, V. jugularis, A. femoralis as well as V. femoralis) and nerves (N. vagus and N. femoralis) the PDT took place directly in the open operation site. The effects of the photodynamic therapy on large blood vessels, nerves, microcirculation as well as the surrounding tissue were histologically examined and evaluated. Supplemantary fluorescence microscopic investigations were carried out to achieve additional information about the localization of the photosensitizer at different time intervals after injection. Our results haven shown that mTHPC mediated intra-operative PDT led to partly significant histological impact onto the vital structures in the irridation area. As described in literature, the stronger tissue reactions were caused by a light dose of 20 J/cm2 as well as by using shorter treatment intervals (24 hours in relation to 96 hours). The consequence of the very short treatment interval (3 minutes) on the other hand was only minimal damage. The mainly observed photodynamic effects on the blood vessels were hyperplasia of the vessel wall cells up to obliteration, formation of cobblestone endothelium, separation of the endothelium of venous vessels as well as thrombosis, but this did not result in any clinical symptoms. In seven of altogether 148 cases the vessels showed thrombosis or obliteration. The photodynamic therapy further led to a decrease of the myelin sheaths of the nerves however without any paresis. The striated musculature as well as the other surrounding tissues is subject to a pronounced necrosis. There were no systemic side effects only due to PDT observed. Four of the however altogether 48 animals suffer from incurable respiratory symptoms. Three rabbits died of this, one had to be sacrificed. These four animals were subject to the strongest treatment conditions, 24 hours and 20 J/cm². Probably it was a matter of a subclinical disease which exists already before PDT, and the death of the animals is not due to the PDT. Some complications in woundhealing like developing of abscesses are common in rabbits and are not to see as consequence of the PDT. The results from the histological investigations stood contrary to the fluorescence localization of the photosensitizer in the tissue. The strongest fluorescence was present in the lumen of the blood vessels partially at level of the endothelial cells, furthermore perivascular and perimysial. Briefly after the injection (6 minutes) absolute fluorescence was largest. 24 hours after the injection it was clearly smaller and after 72 hours fluorescence was hardly noticeable. Summarizing from these findings it can be concluded that intraoperative PDT with mTHPC leads to substantial histological changes of the large blood vessels as well as the nerves and the surrounding tissues. The extent of damage the depended on treatment parameters, however clinical or vital complications were not observed. mTHPC mediated intraoperative PDT seems to be a promising and safe treatment option which could complement existing treatment modalities in order to improve total survival rate in tumour patients