Das primäre Ziel dieser Arbeit ist es, In-Vitro nachzuweisen, dass
antiretrovirale Wirkstoffe ver-schiedener Substanzklassen die Bildung der
CYP3A4-mRNA in den Zelllinien HepG2 und Co-lo320 induzieren können. Zusätzlich
wurde die CYP3A4-Expression in verschiedenen Zellkultu-ren anhand der mRNA-
Bestimmung untersucht. Für die Versuchsreihe wurden die Zelllinien HeLa,
HepG2, Caco-2, Colo320 und humanes Le-bergewebe auf ihren Gehalt an
CYP3A4-mRNA getestet. Die Inkubationsversuche wurden mit den Zelllinien HepG2
und Colo320 durchgeführt. Getestet wurden die antiretroviralen Substan-zen
Abacavir, Amprenavir, Zidovudin Didanosin, Stavudin, Saquinavir, Zalcitabin,
Efavirenz, Nevirapin, Delavirdin, Indinavir, Lopinavir/Ritonavir und
Nelfinavir. Als Referenzsubstanz für die Wirkung auf die CYP3A4-mRNA-Bildung
wurde der bekannte CYP3A4-Induktor Rifampi-cin eingesetzt. Die
Inkubationsversuche erfolgten auf Zellkulturplatten mit 6 Kavitäten. Jede Ka-
vität enthielt etwa eine Million Zellen. Die Zellen wurden 20 Stunden bei 37°C
mit der Testsub-stanz in unterschiedlichen Konzentrationen inkubiert. Nach
erfolgter Inkubation wurde die ge-samte RNA aus den Zellen in einem isoliert
und in cDNA konvertiert. Die Quantifizierung der CYP3A4-mRNA erfolgte mittels
Real-Time-PCR am LightCycler (Roche) über einen externen Standard, der in der
Sequenz mit der gemessenen CYP3A4-mRNA identisch war. Die untersuchten
nukleosidischen Reverse-Transkriptase-Inhibitoren (Abacavir, Didanosin,
Lamivudin, Stavudin, Zalcitabin und Zidovudin) induzierten die Bildung von
CYP3A4-mRNA nicht. In der Gruppe der nicht-nukleosidischen Reverse-
Transkriptase-Inhibitoren konnte für die Substanzen Efavirenz und Delavirdin
eine signifikante Induktion der CYP3A4-Expression nach-gewiesen werden, nicht
jedoch für Nevirapin. Für die untersuchten Proteaseinhibitoren Amprenavir,
Indinavir, Nelfinavir, Ritonavir und Saquinavir konnte eine Induktion der
CYP3A4-Expression in den Zelllinien HepG2 und Colo320 gezeigt werden. Die
Substanzkom-bination des Proteaseinhibitors Kaletra® (Lopinavir/Ritonavir)
führte in HepG2-Zellen nicht, jedoch in Colo320-Zellen, zur Induktion der
CYP3A4-Genexpression. In den hier dargestellten Versuchen konnte gezeigt
werden, dass der CYP3A4-mRNA-Gehalt in Zellen der Zelllinie HepG2 mit
zunehmender Passagezahl abnimmt. Auch konnte nachgewiesen werden, dass die
Zelllinien HepG2 und Colo320 geringere Mengen an CYP3A4-mRNA als Zellen
humanen Le-bergewebes enthalten. Die in dieser Arbeit dargestellten
Inkubationsversuche wurden erstmalig mit den Zelllinien HepG2 und Colo320
durchgeführt. Mit dieser Arbeit gelang es zum Zeitpunkt der Experimente eine
induktive Potenz für die untersuchten Proteaseinhibitoren nachzuweisen. So
zeigen die Er-gebnisse der hier vorgestellten Arbeit trotz der bekannten
inhibitorischen Wirkung der Proteas-einhibitoren eine Zunahme des CYP3A4-mRNA
in den Zellen und somit ein wenn auch schwach ausgeprägtes induktives
Potential der Wirkstoffe. Dabei handelt es sich bei den verwendeten Zelllinien
nur um Modelle, die sich auf Grund der unterschiedlichen Genmuster von humanen
Leberzellen oder Darmepithelzellen unterscheiden und nicht 1:1 auf den
Menschen übertragen werden können.The primary objective of this work is to demonstrate in vitro that
antiretroviral drugs can induce CYP3A4 mRNA in cell cultures. In addition, the
CYP3A4 expression in various cell cultures was examined by determination of
the CYP3A4-mRNA in these cultures. For the series of exper-iments, the cell
lines HeLa, HepG2, Caco-2, Colo320 and human liver cells were tested for their
content of CYP3A4-mRNA. The incubation experiments were carried out using the
cell lines HepG2 and Colo320. We tested the antiretroviral drugs abacavir,
amprenavir, zidovudine, dida-nosine, stavudine, saquinavir, zalcitabine,
efavirenz, nevirapine, delavirdine, indinavir, lop-inavir/ritonavir and
nelfinavir. As a reference substance for the induction the well known
CYP3A4-inducer rifampicin was used. The incubation experiments were carried
out in cell cul-ture 6-well-plates. Each well contained approximately one
million cells. The Cells were treated with the test substances in various
concentrations. After an incubation period of 20 hours at 37°C, the total RNA
was isolated from the cells and converted to cDNA. Quantifying the CYP3A4 mRNA
was carried out by using real-time PCR with the LightCycler-System (Roche). An
external standard that was identical in sequence to the measured CYP3A4 mRNA
was used to quantify the mRNA amount. The investigated nucleoside reverse
transcriptase inhibitors (abacavir, didanosine, lamivudine, stavudine,
zalcitabine, and zidovudine) did not induce the formation of CYP3A4-mRNA in
the investigated cell lines. In the group of non-nucleoside reverse
transcriptase inhibitors, a signifi-cant induction of CYP3A4 expression could
be demonstrated for the substances efavirenz and delavirdine, but not for
nevirapine. For the investigated protease inhibitors amprenavir, indinavir,
nelfinavir, ritonavir and saquinavir induction of CYP3A4 expression in the
cell lines HepG2 and Colo320 could be shown. The compound of the protease
inhibitor Kaletra ® (lopinavir/ritonavir) did not induce the CYP3A4 gene
expression in HepG2 cells but it did in Colo320 cells. The pre-sented
experiments demonstrate that the CYP3A4-mRNA content decreases in the cells of
the cell line HepG2, with increasing passage number. It was also demonstrated
that the cell lines HepG2 and Colo320 contain lower amounts of CYP3A4 mRNA
than cells of human liver tissue. With this study it was possible at the time
of the experiments to prove an inductive power for the investigated protease
inhibitors and some of the non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors.
Despite the well known inhibitory effect of protease inhibitors in vivo, these
study present in-vitro an increase of CYP3A4-mRNA in cell-lines
