Prionen verursachen transmissible spongiforme Enzephalopathien wie Scrapie,
die bovine spongiforme Enzephalopathie oder die Creutzfeldt-Jakob-Krankheit
und bestehen aus fehlgefaltetem, aggregierten Prionprotein (PrP). Aufgrund
ihrer hohen Toleranz gegenüber üblichen Desinfektionsverfahren stellen sie
sowohl eine besondere Herausforderung als auch ein exzellentes Paradigma für
die Aufbereitung von chirurgischen Instrumenten dar. Tatsächlich haben sich
Prionen bereits als aussagekräftige Modellpathogene für die Entwicklung neuer
Formulierungen zur hochwirksamen Desinfektion auch von Bakterien, Viren und
Pilzen bewährt. Um Prionen zukünftig in größerem Umfang als Testerreger zur
Entwicklung neuer Mittel und Verfahren für die Breitspektrumdesinfektion ohne
Rückgriff auf Tierversuche nutzen zu können, wurden in dieser Arbeit in vitro-
Ersatzmethoden für Prion-Bioassays in Nagetieren aufgebaut und validiert. Zur
quantitativen biochemischen Bestimmung der PrP-konvertierenden Keimaktivität
des Scrapie-assoziierten Prionproteins wurde ein spezifisch adaptierter
Protein Misfolding Cyclic Amplification (PMCA)-Assay etabliert. Mit hamster-
adaptierten Scrapie-Prionen (Stamm 263K) kontaminierte Stahlstifte wurden
verschiedenen Desinfektionsbehandlungen und anschließend einer quantitativen
PMCA unterzogen. Die Ergebnisse des PMCA-Assays wurden dann mit bereits früher
erhobenen Bioassay-Daten zur Reduktion infektiöser Priontiter durch die
angewandten Desinfektionsverfahren verglichen. Zusätzlich dazu wurde ein
Zellkulturassay mit primären Gliazellen aus Hamstern zum biologischen in
vitro-Nachweis der Keimaktivität des Prionproteins entwickelt. Der Nachweis
von Scrapie-assoziierter Keimaktivität an Stahlstiftprüfkörpern in der
quantitativen PMCA übertraf die Sensitivität des Nachweises von
Prioninfektiosität im Tierversuch um mindestens eine Größenordnung. Dabei
konnte die Reduktion der Prioninfektiosität an Stahlstiftprüfkörpern durch 16
verschiedene Desinfektions-verfahren mit Titerreduktionen von weniger als
101-fach bis zu größer oder gleich 105,5-fach durchgängig korrekt abgeschätzt
werden. Mittels PMCA biochemisch nachgewiesene Keimaktivität ließ sich auch
biologisch in der Zellkultur detektieren. Konzeptionell deuten die Befunde
dieser Arbeit darauf hin, dass die proteinöse Keimaktivität und pathogene
Infektiosität von 263K Scrapie-Prionen biochemische und biologische
Manifestationen desselben molekularen Prinzips darstellen. In praktischer
Hinsicht steht mit der Gliazellkultur-gekoppelten PMCA potentiell eine
gleichwertige oder sogar überlegene Alternative zum Prion-Bioassay in Tieren
zur Verfügung.Prions are misfolded, aggregated prion proteins (PrP) and the causative agents
of transmissible spongiform encephalopathies such as scrapie, bovine
spongiform encephalopathy (BSE) or Creutzfeldt-Jakob disease. Prions are
pathogens with an unusually high tolerance to inactivation and constitute a
complex challenge as well as an informative paradigm for the re-processing of
surgical instruments. They have been exploited successfully as model pathogens
for the development of novel disinfectants with simultaneous activity also
against bacteria, viruses and fungi. In order to further facilitate the use of
prions as model agents in the search for novel broad-range disinfectants
without the use of animal experiments we established and validated an
experimental platform for the sensitive quantitative measurement and
biological detection of scrapie seeding activity in vitro. We used
specifically adapted serial protein misfolding cyclic amplification (PMCA) for
the quantitative biochemical detection of the seeding activity of scrapie
associated prion protein. Steel wires contaminated with 263K scrapie prions
were subjected to different decontamination procedures and subsequently
analysed by quantitative PMCA. The results of the PMCA assay were validated by
comparison to bioassay data previously established for similar treatments of
steel wires. Furthermore a novel cell culture assay of cerebral glial cell
cultures from hamsters was established for the biological detection of 263K
scrapie seeding activity. The detection limit for scrapie seeding activity on
steel wires in the PMCA assay exceeded that for prion infectivity detected by
bioassay at least tenfold. The residual scrapie infectivity’s on test wires
treated with 16 different disinfection procedures yielding scrapie titre
reductions of ≤101- to ≥105.5-fold could be correctly deduced, for all
examined procedures, from our quantitative seeding activity assay. In
addition, we found that scrapie seeding activity biochemically detected by
PMCA could be also demonstrated biologically in the cell culture assay.
Conceptually, the findings from this work suggested the seeding activity and
infectivity of 263K scrapie prions as corresponding biochemical and biological
manifestations of the same replicative molecular principle. In practical
terms, our biochemical and biological in vitro assays, when combined,
potentially provide a coequal or even superior alternative to titrations of
scrapie infectivity in animals. In vitro-detection of the seeding activity of
scrapie associated prion protein: A superior alternative to titrations of
scrapie infectivity in animal
