Die chronische Infektion mit Helicobacter pylori ist der stärkste Risikofaktor
für das Magenkarzinom. Die Erkennung des Bakteriums erfolgt über den
intrazellulär lokalisierten, mustererkennenden Rezeptor NOD1. Dieser
vermittelt über die Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-ĸB eine
Zytokinantwort, unter anderem mit Ausschüttung von IL-1β. Der SNP rs2075820
kodiert für einen Basenaustausch im NOD1-Gen. Er führt zu einem
Aminosäureaustausch in der NBD-Domäne des Rezeptors. Ziel dieser
retrospektiven monozentrischen Studie war es, die epidemiologische Bedeutung
der Allele des SNPs rs2075820 für das Magenkarzinom zu untersuchen. In einer
Überexpressionsstudie in HEK293-Zellen und in Stimulationsexperimenten an
humanen Monozyten sollte die Auswirkung der rs2075820-Genotypen auf die
Funktion des NOD1-Rezeptors studiert werden. 269 Magenkarzinompatienten und
188 gesunde Kontrollprobanden wurden mittels LightCycler®-PCR für den SNP
rs2075820 genotypisiert und die Allel- und Genotypfrequenzen miteinander
verglichen. Im Patientenkollektiv wiesen 54 % den G/G-, 38 % den G/A- und 8 %
den A/A-Genotyp auf. Dies entsprach der Genotypenverteilung im
Kontrollkollektiv. Bei den Patienten mit dem A/A-Genotyp wurde das
Magenkarzinom in einem signifikant früheren Tumorstadium diagnostiziert als
beim G/A- und beim G/G-Genotyp; die Hälfte der Träger des A/A-Genotyps wurden
im UICC-Stadium I diagnostiziert, die Träger des G/A- und G/G-Genotyps nur in
jeweils einem Viertel der Fälle. Patienten mit dem A/A-Genotyp wiesen zudem
seltener Fernmetastasen bei Erstdiagnose auf und wurden häufiger mit primär
kurativer Intention behandelt. Sie überlebten deutlich länger als solche mit
den Genotypen G/A bzw. G/G. Zur funktionellen Charakterisierung des SNPs
rs2075820 wurden beide Allele in HEK293-Zellen überexprimiert, eine
Stimulation mit dem NOD1-spezifischen Liganden iE-DAP durchgeführt und
anschließend in einem Reportergen-Assay die NF-ĸB-Aktivierung gemessen. Das
A-Allel wies eine stark verminderte Liganden-vermittelte Aktivierung des
Transkriptionsfaktors NF-ĸB auf. Eine Sequenzierung der eingesetzten Vektoren
zeigte jedoch, dass der NOD1-Referenz Vektor, der in der Mutagenese eingesetzt
wurde, an Position 1733 eine Base enthält, die von der NOD1-Referenzsequenz
abweicht und zu einem Aminosäureaustausch führt. Bei den
Stimulationsexperimenten an humanen Monozyten wiesen Monozyten mit dem
A/A-Genotyp im Gegensatz zu Monozyten mt dem G/G-Genotyp eine abgeschwächte
ligandenvermittelte IL-1β-Ausschüttung auf. Die Genotypisierungsstudie zeigte,
dass weder einzelne Allele noch Genotypen des SNPs rs2075820 mit dem
Magenkarzinom assoziiert sind. Jedoch erwies sich der A/A-Genotyp durch ein
lokal begrenztes Tumorstadium bei Diagnosestellung und ein längeres medianes
Überleben als ein prognostisch günstiger Faktor. Die funktionellen
Untersuchungen weisen dabei auf eine verringerte Aktivierbarkeit des
NOD1-Rezeptors bei dem A/A-Genotyp hin. Die Aussagekraft des
Überexpressionsversuchs in HEK-Zellen wird hauptsächlich durch den
Basenaustasch im Referenz-Vektor limitiert, die der
Monozytenstimulatiosexperimente vor allem durch die Vielzahl an
experimentellen Schritten und die daraus resultierenden möglichen
Fehlerquellen. Weitere Experimente sind notwendig, um die Auswirkung des SNP
rs2075820 auf die Funktion des NOD1-Rezeptors genauer und umfassend
beschreiben zu können.Chronic infection with H. pylori is the strongest risk factor for gastric
cancer. The intracellular pattern recognition receptor NOD1 activates a
cytokine response via the transcription factor NF-ĸB in response to H. pylori
infection. Among others, the cytokine IL-1β is released. Aim of this
retrospective single centre study was to examine the epidemiologic relevance
of the non-synonymous SNP rs2075820, which leads to a glutamate (genotype G)
to lysine (genotype A) substitution in the nucleotide binding domain, for
gastric cancer. In an overexpression experiment in HEK293 cells and by
stimulation of humane monocytes, we studied the effect of the different
genotypes on the function of the NOD1 receptor. We genotyped 269 patients with
gastric cancer and 188 healthy controls by quantitative PCR and compared the
allele and genotype frequencies between the two groups. The genotype
frequencies in patients with gastric cancer were 54 % (G/G), 38 % (G/A), and 8
% (A/A). This corresponded to the genotype frequencies determined in our
healthy controls. Patient with the A/A genotype were significantly more often
diagnosed at an early tumour stage compared to the G/A and G/G genotype; about
50% of the A/A genotype carriers were diagnosed in the UICC tumour stage I
compared to only 25 % of the patients carrying the G/A or G/G genotype.
Patients with the A/A genotype less often presented metastatic disease at the
time of diagnosis and were more often treated with curative intention. Their
mean survival time after diagnosis was longer than that of patients with G/G
or G/A genotypes. To functionally characterise the SNP rs2075820, we
overexpressed both alleles in HEK296 cells and later on stimulated these cells
with the NOD1-specific ligand ieDAP. Finally, the expression of NF-ĸB was
measured in a reporter gene assay. Cells expressing the A allele displayed a
markedly diminished activity of NF-ĸB. In the monocyte stimulation experiment,
human monocytes with the A/A genotype showed diminished ligand-induced IL-1β
secretion compared to those with the G/G genotype. The genotype study showed
no association between the SNP rs2075820 and the incidence of gastric cancer.
However the A/A genotype was associated with a favourable prognosis with a
longer median survival time and an earlier tumour stage at the time of
diagnosis. The overexpression experiments indicate that the NOD1 receptor
encoded by the A allele may be less activatable. However the validity of the
overexpression experiments is limited , because complete sequencing of the
vectors for both alleles revealed that both carry a synonymous mutation from
the reference sequence which results in a leucin to proline substitution in
the NOD1 protein. The monocyte simulation assay has a complex set up and is
hence prone to errors. For a more precise characterisation of the effects of
the rs2075820 alleles on the function of the NOD1 receptor, further studies
are needed.
