1 Introduction 5 1.1 Nanoparticles 5 1.2 Advantages and Applications of
Cationic Nanoparticles 8 1.2.1 Enhanced Cellular Uptake and Endosomal Escape 8
1.2.2 Complexation of Nucleic Acids 11 1.3 Adverse Effects of Nanoparticles 13
1.3.1 Systemic Effects 13 1.3.2 Cellular and Subcellular Mechanisms 15 1.4
Strategies to overcome adverse effects 22 1.4.1 Nanoparticle Materials 22
1.4.2 Biodegradability 24 2 Scientific Goal 26 3 Publications and Manuscripts
28 3.1 Systematic Adjustment of Charge Densities and Size of Polyglycerol
Amines Reduces Cytotoxic Effects and Enhances Cellular Uptake 28 3.2
Crosslinked Redox-Responsive Micelles Based on Lipoic Acid-Derived Amphiphiles
for Enhanced siRNA Delivery 42 3.3 Synthesis of pH-Cleavable dPG-Amines for
Gene Delivery Application 71 3.4 Defined pH-Sensitive Nanogels as Gene
Delivery Platform for siRNA Mediated in vitro Gene Silencing 106 3.5 FLIM-ROX
as a Highly Sensitive Fluorescence Lifetime Based Approach for Reliable
Reactive Oxygen Species Detection in vitro and in vivo 122 4 Conclusions and
Outlook 163 5 Kurzzusammenfassung 165 6 References 168 7 Appendices 179 7.1
List of other Publications 179 7.2 Abbreviations 180The goals of this work were the development of new cationic carrier systems
that are able to transport sensitive nucleic acid cargo into cells while at
the same time de-creasing their adverse effects. This was realized with the
use of PG as the polymeric backbone of the carrier systems and a cleavable
linker that enables the particles bio-degradability in the cytosol and also a
release of the cargo material. The first project was a systematic approach to
find a best candidate in the frame of hyperbranched polyglycerol nanocarriers
by tweaking both the size and the hydroxyl-to-amino ratio on the particle
surface. The particles were tested for their performance to transfect plasmid
DNA in vitro. Among several candidates, PG with a size of 14 kDa and 90 % of
amine surface groups and PG 200 kDa with 30 % amine groups were the most
promising candidates. These findings are in accord with those of Zeng et al.,
where 14 kDa particles worked best with 50 % amines and 55 kDa particles
worked best with 35 % amines for siRNA delivery. The best candidate with
similar transfection efficacies as PEI, 200 kDa HPG and 30 % amines, were
further studied to elaborate their exact mechanism of toxicity. Compared to 25
kDa branched PEI (bPEI), the cell viability was less affected. Additional
tests revealed no evidence for apoptosis but a slight membrane disruption
which was more prominent in PEI than in the HPG. In the second project,
micelles based on lipoic acid and PG were combined with a redox sensitive
disulfide crosslinker for the delivery of siRNA. All biocompatible build-ing
blocks were selected so that there will be no toxicity upon particle
degradation and four different structure were generated. Acceptable cell
viabilities (> 70 %) were ob-served for all but one construct up to an N/P
ratio of 120. One of the three candidates showed comparable transfection
efficacy to the commercial control Lipofectamine® but was still lower. Two
other approaches featured the efficacy of different PG poly-mer structures for
transfection: hyperbranched PG with an amine shell and a PG nano-gel with
small 600 Da PEI units. Both these systems incorporated a pH sensitive cleav-
able linker. The HPG carriers contained a cleavable linker (50 % cleaved after
12 hours) and a fast-cleavable variety of that (50 % cleaved after 4 hours).
The cell viabil-ity of the non-degradable carrier and the two degradable ones
was comparable and the cleavable one also showed similar transfection
efficacy. However, the fast-cleavable carriers showed a decreased performance,
indicating that the degradation process needs to be delayed for efficient
transfection. The other benzacetal-linker sys-tem was a crosslinked nanogel
comprising linear PG and small linear PEI molecules. This system was able to
physically encapsulate siRNA during the synthesis process and showed a
transfection efficacy similar to that of 25 kDa bPEI. Also, the cell viability
was higher, especially at higher concentrations and a subsequent test using
red blood cells showed high biocompatibility with biological membranes,
whereas PEI showed a visi-ble disruptive effect. The nanogel approach also
eliminated the need for complexation of nucleic acids and the carrier system
prior to application, making them more feasi-ble in practical use. This
feature and the increased biocompatibility makes these sys-tem promising
candidates for further in vivo tests. Another project focused on the sensitive
detection of reactive oxygen species upon nanoparticle exposure. For this,
fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) was utilized because it
increased the sensitivity of the commercial CellROX Green® dye. Calibration
curves proved the high functionality of the method in fixed and live cells.
Further studies on ex vivo skin tissue demonstrated the methods applicability
for more complex systems. Also, to consolidate the picture that the ROS
generation by model particles made of bioinert gold with an amine shell, other
biological studies were per-formed. These studies revealed induction of
cellular senescence and genotoxic effect at subtoxic concentrations as
determined by cell viability studies. The results confirm the overall picture
of cationic nanoparticle induced adverse effects on cells and legiti-mate this
FLIM method for further routine application for toxicological tests. For the
future, these polycationic nanoparticle delivery system will be further ex-
plored for their in vitro and in vivo application of nucleic acid delivery, or
gene deliv-ery, and the delivery of other drugs. The challenge of
outperforming viral carrier sys-tems or decreasing the adverse effects
completely have not yet been entirely accom-plished. Further work will be done
on the nanogels due to their flexible size range and the ability to
encapsulate a great variety of different cargoes. Also, the interactions of
nanoparticles and cells regarding adverse effects needs to be further
elucidated. As a sensitive method for the detection of ROS was established in
the last project using FLIM, further effort can be taken to eliminate subtoxic
oxidative stress and possibly outperform current drug delivery systems.Das Ziel dieser Arbeit bestand aus der Entwicklung kationischer Nanopartikel-
Trägersysteme, die in der Lage sind, sensible Gast-Moleküle wie Nukleinsäuren
in Zel-len zu transportieren und gleichzeitig ihre adversen Effekte zu
reduzieren. Realisiert wurde das durch die Verwendung von Polyglycerin als
Polymergrundlage des Träger-systems und spaltbarer, Stimuli-responsiver
Querverbindungen. Diese ermöglichten die Bioabbaubarkeit der Partikel im
Zytosol und den Lysosomen und die Freisetzung der Gastmoleküle. Das erste
Projekt bestand aus einer systematischen Herangehensweise, um das beste
Konstrukt eines hochverzweigten, Polyglycerin-basierten Nanoträgers zu finden.
Hierzu wurden sowohl die Größe als auch das Verhältnis von Hydroxyl- zu
Aminogrup-pen auf der Partikeloberfläche moduliert. Anschließen wurden die
Partikel auf ihr Fä-higkeit getestet, in vitro Plasmid DNA in Zellen zu
transfizieren. Unter mehreren Kan-didaten stellten sich PG mit einer Größe von
14 kDa mit 90 % Aminogruppen und 200 kDa mit 30 % Aminogruppen als die besten
heraus. Damit konnten die Ergebnisse von Zeng et al bestätigt werden, wonach
14 kDa Partikel mit 50 % Aminogruppen und 55 kDa partikel mit 35 %
Aminogruppen am besten für die Transfektion von siRNA geeig-net waren.[152]
Der beste Kandidat mit einer vergleichbaren Transfektionseffizienz wie PEI,
200 kDa HPG mit 30 % Aminogruppen, wurde des Weiteren auf die Mechanismen der
Toxizität geprüft. Im Vergleich zu 25 kDa bPEI (bPEI) war die Zellviabilität
allge-mein weniger beeinträchtigt. Zusätzliche Tests zeigten keine Anzeichen
von Apoptose-Induktion, aber eine leichte Störung der Membranintegrität, wobei
der Effekt durch PEI deutlicher ausgeprägt war. Im zweiten Projekt wurden
Liponsäure und PG mit einer redox-sensitiven Verknüp-fung kombiniert, um siRNA
zu transfizieren. Alle Grundbausteine wurden so gewählt, dass bei einer
Spaltung keine toxischen Abbauprodukte freigesetzt werden und vier
verschiedene Konstrukte untersucht. Für drei von vier Konstrukte wurde eine
akzeptab-le Zellviabilität festgestellt, bis zu einem N/P-Verhältnis von 120.
Einer der drei Kandi-daten zeigte eine Transfektioneffizienz, die mit der
kommerziell erhältlichen Kontrolle Lipofectamine ® vergleichbar war, wenn auch
etwas niedriger. Zwei andere Herange-hensweisen befassten sich mit der
Effizienz anderer PG Polymerkonstrukte für Trans-fektionen: hochverzweigtes PG
mit einer Amin-Schale und ein PG-Nanogel mit kleinen 600 Da PEI Einheiten.
Beide Systeme beinhalten eine pH-sensitiven Querverbindung. Die HPG Träger
wurden mit einer spaltbaren Queverbindung und einer schnell-spaltbaren
Variante davon ausgestattet, wobei 50 % der Träger nach 12 Stunden bzw. 4
Stunden gespalten wurden. Die Zellviabilität des Trägers ohne spaltbare
Querverbin-dung und dieser beiden Konstrukte waren sehr ähnlich, aber nur das
spaltbare zeigte eine vergleichbare Transfektionseffizienz zu dem nicht-
spaltbaren. Die schnell-spaltbare Variante allerdings zeigte eine schlechtere
Performance, was darauf hindeu-tet, dass der Spaltungsvorgang für eine
effiziente Transfektion langsamer von statten gehen muss. Das andere pH-
sensitive, Benzazetal-verknüpfte System bestand aus Na-nogelen bestehend aus
PG und kleinen, linearen PEI Einheiten. In diesem System konn-te siRNA während
der Synthese physikalisch eingekapselt werden. Die Transfektioneffi-zienz
dieses Konstrukts war vergleichbar, wenn auch niedriger, mit der von 25 kDa
bPEI. Andererseits war die Zellviabilität höher, vor allem bei hohen
Konzentrationen. Ein zusätzlicher Test an roten Blutzellen demonstrierte eine
hohe Biokompatibilität gegenüber biologischen Membranen, während PEI einen
deutlichen schädlichen Effekt zeigte. Der Nanogel-Ansatz als Träger-System
eliminiert außerdem die Notwendigkeit für eine Komplexierung von Nukleinsäuren
vor der Anwendung, da diese bereits ver-kapselt sind. Das macht sie in der
Anwendung vergleichsweise praktikabel. Insgesamt machen die Vorteile der
erhöhten Biokompatibilität und der Einfachheit der Anwen-dung dieses System zu
einem vielversprechenden Kandidaten für spätere in vivo Versu-che. Ein anderes
Projekt war auf die sensitive Detektion von reaktiven Sauerstoffspe-
ziesfokussiert, welche bei Kontakt mit Nanopartikeln freigesetzt werden
können. Dafür wurde der Farbstoff CellROX Green ® in Kombination mit
Fluorescence Lifetime Ima-ging Microscopy (FLIM) verwendet, um dessen
Sensitivität zu erhöhen. Durch Kalibra-tionskurven konnte die Funktionalität
der Methode sowohl in fixierten als auch in le-benden Zellen gezeigt werden.
Des Weiteren konnte die Anwendbarkeit der Methode für komplexere biologische
Systeme anhand von ex vivo Versuchen demonstriert wer-den. Um das Gesamtbild
um den gemessen oxidativen Stress zu vervollständigen, wur-den Modell-Partikel
aus Gold mit einer Amin-Schale verwendet und weitere biologi-sche
Untersuchungen durchgeführt. Dazu wurden Zellviabilitätsstudien durchgeführt
und subtoxische Konzentrationen verwendet. Diese demonstrierten neben den der
Ge-nerierung von ROS auch die Induktion von zellulärer Seneszenz und einen
genotoxi-schen Effekt. Die Ergebnisse bestätigten das allgemeine Gesamtbild
der adversen Ef-fekte von kationischen Nanopartikeln auf Zellen und
legitimierten damit diese neue FLIM-Methode und deren möglichen Einsatz in
Routine-Kontrollen im Zusammenhang mit medizinischen Anwendungen. Für die
Zukunft werden diese vielversprechenden kationischen Nanopartikel-
Trägersysteme weiter erforscht, sowohl für die Anwendung mit Nukleinsäuren als
auch anderen Arzneistoffen und das sowohl in vitro als auch in vivo. Die
Herausforderung, virale Vektorsysteme zu übertreffen oder die adversen Effekte
komplett zu eliminie-ren, ist noch nicht gemeistert. Weitere Arbeit sollte in
die Nanogel-Systeme gesteckt werden, da diese durch ihre flexible Größe und
der Möglichkeit zur Einkapselung ver-schiedenster Arzneimittel ein besonders
großen Potential haben. Zusätzlich sollten die Interaktionen zwischen
kationischen Nanopartikeln und Zellen sowie die adversen Ef-fekte weiter
aufgeklärt werden. Da mit dieser Arbeit eine sensitive Methode für die Messung
von ROS mittels FLIM-Technologie etabliert wurde, sollte diese genutzt wer-
den, um die adversen Effekte bei toxischen und subtoxischen Konzentrationen
weiter zu eliminieren. Auf lange Sicht könnte das eine aussagekräftige Methode
sein, aktuelle Trägersysteme weiter zu untersuchen und zu verbessern
