Yersinia enterocolitica ist ein häufiger Durchfallerreger. Um die der Diarrhö
und Barrierestörung zugrundeliegenden Mechanismen aufzuklären, wurden die
erregerspezifischen Pathomechanismen in einem humanen Kolonkarzinom-
Zellkulturmodell detailliert analysiert. Die Infektion der als epithelialer
Monolayer wachsenden humanen Kolonkarzinom-Zelllinie HT-29/B6 führte zu einer
ausgeprägten Reduktion des transepithelialen Widerstands (Rt, TER) und einer
Zunahme der Permeabilität für Mannitol (182 Da) und Fluorescein (332 Da). Der
als Kurzschlussstrom gemessene aktive Ionentranport war unverändert. Die
Veränderungen erfolgten zeit- und dosisabhängig und konnte nur durch den
lebenden Erreger selbst, nicht aber durch bakterielle Kulturüberstände
induziert werden. Typische Yersinia-Virulenzfaktoren, wie Invasin oder die
Expression des Yersinia-Virulenzplasmids pYV waren nicht ursächlich. Y.
enterocolitica induzierte in HT-29/B6-Zellen Nekrosen, was durch eine
gesteigerte LDH-Freisetzung nachgewiesen wurde. Apoptosen traten nicht
vermehrt auf. Mit Hilfe der Conductance-Scanning-Technik konnten in
infizierten Monolayern lokale Leitfähigkeitsänderungen detektiert sowie durch
Biotinylierung und anschließende Laserscanning-Mikroskopie visualisiert
werden. Innerhalb dieser als leaky regions definierten Bereiche waren die
barrierebildenden Claudine 3, 4 und 8 aus der Tight Junction in das Zytoplasma
umverteilt. Zusätzlich zeigten Western Blot-Analysen eine verminderte
Expression von Claudin-2, -3, -8, -10 und ZO-1. Darüber hinaus konnte eine
Regulation der Claudin-8-Expression über die terminale c-Jun-Kinase
nachgewiesen werden. Die Inhibition der Kinase bewirkte eine Abschwächung des
durch Y. enterocolitica verursachten Rt-Abfalls sowie eine vollständige
Wiederherstellung der Proteinexpression von Claudin-8. Somit wird die von Y.
enterocolitica induzierte Barrierestörung durch lokale Tight Junction-Defekte
und Nekroseinduktion hervorgerufen. Im Gesamtorganismus würden diese
Mechanismen einerseits zu einem gesteigerten Übertritt von Antigenen aus dem
Lumen in die Blutbahn führen und andererseits einen vermehrten Übertritt von
Soluten und Wasser vom Blut ins Lumen verursachen, der zu einer Leckflux-
Diarrhö führen kann. Der Escherichia coli-Stamm Nissle 1917 (EcN) kommt seit
Jahren als Probiotikum bei der Behandlung von Diarrhöen und inflammatorischen
Darmerkrankungen zum Einsatz. Um seine die Barriere stärkenden Mechanismen
aufzuklären, wurde in dieser Arbeit der Einfluss des hochwirksamen EcN-
Kulturüberstands auf die Tight Junction-mediierte Barrierefunktion in vitro am
HT-29/B6-Zellkulturmodell untersucht. Aus EcN-Kulturen präparierte Überstände
(EcNK) verursachten eine Verdopplung des Rt und eine Verminderung der
Permeabilitäten für Mannitol und NaCl und somit eine Abdichtung der
epithelialen Barriere. Das bekanntermaßen immunstimulatorisch wirkende EcN-
Flagellin war hierfür nicht verantwortlich. Messungen mittels Zwei-Wege-
Impedanzspektroskopie offenbarten insbesondere eine Zunahme des parazellulären
Widerstands. Die für verschiedene Tight Junction-Proteine (Occludin,
Tricellulin und Claudine sowie das TJ-assoziierte Protein ZO-1) durchgeführten
Expressionsanalysen zeigten ausschließlich eine Zunahme der Protein- und mRNA-
Level von Claudin-14 durch EcNK. Mittels Hitzeinaktivierung des EcNK konnten
die Effekte auf Rt und Claudin-14-Expression aufgehoben werden. Die
barriererelevante Funktion des bisher kaum charakterisierten
Claudin-14-Proteins bestätigte sich abschließend im siRNA-Transfektionsansatz.
Somit ist die im HT-29/B6-Modell durch EcNK induzierte Barriereprotektion auf
eine Hochregulation von Claudin-14 zurückzuführen.Yersinia enterocolitica is a common cause of acute gastroenteritis. In order
to clarify the mechanisms leading to diarrhea and barrier dysfunction the
pathomechanisms of this infection were studied in detail. Exposure of human
colonic HT-29/B6 cells to Y. enterocolitica resulted in a decrease in
transepithelial resistance (Rt, TER) with a parallel increase in mannitol (182
Da) and fluorescein (332 Da) permeability. Active ion transport measured as
short circuit current was unchanged. The Y. enterocolitica induced changes
were time-dependent, required the presence of living bacteria, could not be
triggered by bacterial supernatants, and were not due to Yersinia invasin or
expression from the virulence plasmid pYV. Concomitantly, Y. enterocolitica
induced necrosis as indicated by an increase in LDH-release, while epithelial
apoptosis was not upregulated. Local changes in conductivity were detected by
conductance scanning, indicating leaky regions within the epithelium which
were visualized by biotinylation and confocal laser scanning microscopy. In
these regions, sealing claudin-3, -4 and -8 were redistributed off the tight
junction into the cytoplasm. In addition, the expression of claudin-2, -3, -8,
-10 and ZO-1 was diminished as quantified by immunoblotting. Moreover,
claudin-8 protein expression was found to be regulated via the c-Jun
N-terminal kinase, the inhibition of which partially prevented the Y.
enterocolitica induced decrease in Rt and restored claudin-8 protein level. In
conclusion, barrier dysfunction in Y. enterocolitica infection is due to
circumscribed epithelial tight junction protein changes and necrotic cell
loss. As a consequence leak flux diarrhea and antigen-uptake may be triggered
in human infection. Escherichia coli Nissle 1917 (EcN) is a probiotic
bacterium used for the treatment of inflam-matory bowel disorders. To study
its barrier strengthening mechanisms the in vitro effect of highly active EcN
supernatant (EcNK) on tight junction mediated barrier function was assessed
here using the HT-29/B6 cell culture model. EcNK dissected from bacterial
culture, improved barrier function measured by a two-fold increase in Rt and a
reduction of permeability for mannitol and NaCl. This was not due to
flagellin. Measurements by two-path-impedance spectroscopy revealed a strong
effect on paracellular resistance. When changes of tight junction proteins as
claudins, occludin, tricellulin as well as the scafold protein ZO-1 were
examined, claudin-14 was the only one found to be affected by EcNK. Claudin-14
was elevated on protein- and mRNA-level. Heat treatment of active EcNK
abolished the increase in Rt and the upregulation of claudin-14 protein level.
By silencing claudin-14 in a siRNA-transfection assay, the sealing function of
this so far less well characterized tight junction protein was confirmed. In
conclusion, EcNK improves barrier function in HT-29/B6 by upregulating
claudin-14
