Der BMP-Signalweg nimmt eine essentielle Rolle im Bereich der Musterbildung,
der Organogenese, des Wachstums und der Homöostase des Skeletts ein. Dabei ist
ein fein abgestimmtes Zusammenspiel von Expressionsort, -zeit und -menge sowie
die Proteininteraktion der einzelnen Komponenten im BMP-Signalweg
entscheidend, da bereits geringe Abweichungen während des komplexen
Bildungsprozesses zu Fehlbildungen führen. Ziel dieser Arbeit war die
Aufklärung der Pathogenese zweier Handfehlbildungen, BDA2 und SYNS1, die nach
genetischen Analysen mit Mutationen betreffend der sezernierten Signalmoleküle
BMP2 bzw. GDF5 assoziiert sind. Beide Proteine sind Mitglieder der TGFβ-
Superfamilie und zeigen ein z.T. überlappendes Expressionsprofil während der
embryonalen Extremitätenentwicklung in der Gelenksregion und im Perichondrium.
Die dort verlaufenden Vorgänge sind besonders kritisch für die Etablierung
eines korrekt ausgebildeten Gelenks und der Determinierung der Phalangen. Für
die GDF5 Mutationen N445T und N445K, die mit SYNS1 assoziiert und in der
überlappenden Proteininteraktionsoberfläche mit Nog und BMPR1B lokalisiert
sind, konnte in vitro eine Insensitivität gegenüber dem BMP-Antagonisten Nog
nachgewiesen werden. Dies resultiert in vitro als auch in vivo in einer
verstärkten chondrogenen Aktivität, die zusätzlich die endogene negative
Feedback-Regulation durch Nog umgeht. Die Position N445 ist unter den BMPs
hochkonserviert, jedoch tragen BMP9 und BMP10 natürlicherweise dort ein Lysin
und sind wie die GDF5 Mutanten Nog-insensitiv. Während ein einfacher
Aminosäureaustausch von Lysin mit Arginin keine Nog-Sensitivität in Bmp9
induziert, konnte durch gezielte Mutagenese an zwei weiteren potentiellen
Interaktionsstellen eine nahezu vollständige Nog-Sensitivität vermittelt
werden. Zusätzlich zeigten zu GDF5 N445T analoge Mutationen in BMP2/4/7 keine
Veränderung der Nog-Sensitivität. Daher kann dem Asparagin eine sehr wichtige
Funktion bei der Interaktion mit Nog zugesprochen werden, jedoch ist diese im
Gegensatz zu GDF5 bei weiteren Vertretern der BMPs weniger essentiell. Diese
Erkenntnisse können, im Hinblick auf klinische Anwendungen im Bereich der
regenerativen Medizin, beim Design von BMPs der 2. Generation (Superagonists)
genutzt werden, um eine effektivere Therapie mit geringeren
Proteinkonzentrationen zu ermöglichen. Für die Mikroduplikation 110 kb
downstream von BMP2 konnte mit Hilfe eines transgenen Mausmodels eine
extremitätenspezifische Reportergenaktivität ermittelt werden. Das
resultierende Expressionspattern von LacZ überlappt mit endogener Bmp2
Expression, was auf die Anwesenheit eines Extremitäten-spezifischen
Bmp2-Enhancer in der duplizierten Region hindeutet. Darüber hinaus konnte die
Position der cis regulatorischen Sequenz auf ca. 1 kb eingegrenzt werden.
Diese Ergebnisse haben einen zusätzlichen Pathogenesemechanismus der BDA2
aufgedeckt, der daraufhindeutet, dass durch die Duplikation eines Enhancer die
Expression von BMP2 in der Extremität verändert und das
Signalisierungsgleichgewicht zwischen BMPR1A und BMPR1B verschoben wird. Beide
funktionellen Untersuchungen zur Genotyp-Phänotyp Korrelation untermauern die
hochsensible Regulation des BMP-Signalwegs und bieten grundlegende Einblicke
in die aufeinander abgestimmten Proteininteraktionen, die sich überschneidende
Signalkaskaden während Entwicklungsprozesse ermöglichen.BMP-signalling plays throughout the whole embryonic development and in the
adult organism an essential role in pattern formation, organogenesis, growth
and homeostasis of the skeleton. Especially during the limb development the
fine-tuning of a dose dependent as well as spatially and temporally controlled
expression pattern in combination with defined protein interactions between
the members of the BMP-signalling pathway is crucial. Only small changes in
these complex processes can result in skeletal abnormalities. This PhD thesis
is devoted to clarify the pathogenesis of two skeletal malformations, BDA2 and
SYNS1, which are associated with mutations concerning the secreted signalling
molecules BMP2 and GDF5, respectively. Both proteins are members of the TGFβ-
superfamily and show during limb development an overlapping expression pattern
in the joint region as well as in the perichondrium. Patterning and
differentiation processes at these locations are critical for establishing
correct developed joints and phalanges. The GDF5 mutations N445T and N445K,
which are associated with SYNS1, are situated in the overlapping receptor
(BMPR1B) and antagonist (NOG) interface. Functional in vitro analysis of the
GDF5 variants revealed a Nog-insensitivity and a change of signalling mode.
Both effects result in vivo and in vitro in an enhanced protein activity
supported by circumvented negative feedback loop of Nog. Interestingly, the
residue N445 is highly conserved among the BMP-family except of BMP9 and BMP10
in which it is naturally substituted with lysine. Like the mutant GDF5, both
BMPs are insensitive to Nog and show a high chondrogenic activity. While a
simple exchange of arginine with lysine doesn’t induce Nog-sensitivity,
successive introduction of two additional substitutions imparted high to total
sensitivity on customized variants of Bmp9. Furthermore, homologous mutations
to GDF5 N445T in BMP2/4/7 didn’t lead to Nog-insensitivity in these BMPs.
Taken together, these results suggest a critical role of the asparagine in the
BMP-NOG interaction face, which is less essential in BMPs than in GDF5. Out of
this, these findings are useful for the design of second generation BMPs
(superagonists), which can improve the effectivity of BMPs in low dosages for
clinical applications in regenerative medicine. The microduplication 110 kb
downstream of BMP2, which is associated with BDA2, contains evolutionary
highly conserved sequences. By using a transgenic mouse model it was shown
that this duplicated sequence is able to drive limb-specific reporter gene
expression. The almost complete overlap of LacZ with endogenous Bmp2
expression indicates that a limb specific BMP2 enhancer is located within the
duplicated sequence. Furthermore, the location of the cis-regulatory sequence
was narrowed down to a ~1 kb fragment. These results reveal an additional
pathogenesis mechanism of BDA2 which suggest an altered BMP2 expression
through duplication of the enhancer resulting in a misbalanced BMPR1A and
BMPR1B signaling in the developing limb. Both functional studies in this work
concerning genotype-phenotype correlation emphasize the sensible regulation of
the BMP pathway in the limb. Furthermore, they provide fundamental insights
into the fine tuned protein interactions which make overlapping signalling
cascades possible
