Rabbit enterocolitis is a serious gastrointestinal syndrome appearing in
France since the end of 1996. The disease is characterized by small quantities
of watery diarrhoea followed by a decrease in food intake and finally
resulting in intestinal paralysis. It has high mortality rates (30-80%) and
spreads very rapidly. There is clear experimental evidence that this disease
is produced by Clostridium perfringens. Aim of this work is to characterize
the genotype of the Clostridium strains circulating in Germany and sequence
the major toxin genes. C. perfringens strains were collected from different
rabbit livestocks throughout Germany (including 3 from Italy), and isolated
from the intestine of sick rabbits. All samples were typed via PCR using
consensus primers of the major toxin genes (alpha, beta, epsilon, iota, cpe
and beta2). From a total of 71 strains, all contain the alpha-gene and 25
additionally the beta2-gene. Therefore all are type A Clostridium perfringens.
The alpha-toxin genes were isolated and sequenced, including their immediate
upstream and downstream surroundings. The upstream region contains all
elements necessary for expression, i.e. typical bacterial promoter elements
for transcription initiation and a Shine-Dalgarno-sequence necessary for
translation. No transcriptional termination signals were found at the end of
the coding region, suggesting the alpha-toxin gene to be member of an operon.
The deduced amino acid differences within the 71 alpha-toxins are low and
restricted to certain areas of the protein. All the functionally important
amino acid residues, i.e. the ones involved in metal ion-, membrane-binding
and in the conformational activation, are conserved in all the 71
alpha–toxins. Therefore, it can be concluded that all alpha- toxins are
equally well active. Studies carried on by Gilbert et al., 1997, showed that
beta2 toxin-producing strains are associated with animal diseases such as
necrotic enteritis in piglets and enterocolitis in horses. Therefore, the
beta2-toxin gene, cpb2, was analyzed in the C. perfringens isolated from sick
rabbits as well. The strategy applied to obtain the beta2-gene sequences was
analogous to that for the alpha-toxin genes, i.e. PCR amplification of the DNA
region of interest including upstream and downstream parts of the gene. After
finding the correct PCR primers for the amplification of the beta2-toxin gene
types it could be shown that from the 25 beta2-toxin genes 16 belong to the
so-called “porcine”- and 9 to the “non-porcine”-type. All the “porcine”- and 5
of the “non-porcine”-type genes were sequenced. They contain all regulatory
elements necessary for transcription, i.e. promoter elements and
“hairpin”-termination signals indicationg that monocistronic mRNAs are
produced. 15 of the 16 “porcine”-type beta2-toxin genes display an A-deletion
within the putative signal peptide region, expecting an immediate downstream
translational stop to occur. Only n°6 (Wallenhorst) has an undisturbed open
reading frame and should therefore be expressed as a complete protein. This is
for the first time, that a “porcine-type” beta2-toxin gene isolated from
Clostridia grown in non-porcine animals has this feature. Due to non-solvable
sequencing problems, only 5 of the 9 non-porcine beta2-toxin genes could be
sequenced completely. All display an undisturbed open reading frame. Similar
as within the alpha-toxin samples, the deduced amino acid differences within
each beta2-toxin-type are very low, although being marked between the two
groups. From only the nucleotide sequence data no prediction can be made for
the expression of the two beta2-toxin genes. Therefore, they were cloned into
the bacterial expression vector pASK-IBA6. The cloned genes were expressed as
fusion proteins, offering the possibility to purify the recombinant
beta2-toxins. After immunizing animals, anti-beta2-toxin-specific antibodies
should become available to clarify the problem of the expression of the
beta2-toxin genes. Summarizing all the data on all toxin-specific genes, due
to their low sequence variability, the development of a toxoid vaccine against
rabbit enterocolitis should become feasible.Die sogenannte “Enterocolitis” des Kaninchens wurde zuerst Ende 1996 in
Frankreich beschrieben. Die Erkrankung ist charakterisiert anfangs durch
geringfügigen wässrigen Durchfall, gefolgt von reduzierter Nahrungsaufnahme
mit am Ende völligen Zusammenbruchs intestinaler Aktivität (Darmlähmung).
Mortalitätsraten (30-80%) und die Ausbreitungsgeschwindigkeit sind sehr hoch.
Klare experimentelle Evidenz weist auf Clostridium perfringens als den Erreger
der Erkrankung hin. Ziel dieser Arbeit ist die Charakterisierung der Toxin
Genotypen möglichst vieler in deutschen Kaninchenbeständen kursierender C.
perfringens Stämme und die Sequenzierung ihrer Haupttoxin-Gene. 71
C.perfringens Isolate aus infizierten Kaninchenbeständen (68 aus Deutschland,
3 aus Italien) wurden gesammelt und mittels PCR unter Verwendung von
„consensus“ Oligonukleotiden, charakteristisch für die Haupttoxin Gene (alpha,
ß, ε, i, cpe and beta2), typisiert. Alle 71 Proben enthalten das alpha-Toxin-,
25 zusätzlich das ß2-Toxin-Gen. Daher gehören alle zum Clostridium perfringens
Typ-A. Die alpha-Toxin Gene wurden amplifiziert, zum Teil kloniert und
anschließend sequenziert, einschließlich der strom-aufwärts und –abwärts
Regionen. Die Stromaufwärtsregionen enthalten alle zur Transkription
erforderlichen Elemente, wie bakterielle Promotoren und das für die
Translation notwendige Shine-Dalgarno-Äquivalent. Am Ende des kodierenden
Berichs waren keine Transkriptionsterminationselemente vorhanden, was darauf
hinweist, dass das alpha-Toxin Gen Bestandteil eines Operons ist. Was den
kodierenden Bereich betrifft, ist zu konstatieren, dass die aus der
Nukleotidsequenz abgleiteten Aminosäure-Unterschiede in den 71 alpha-Toxinen
gering sind und zudem auf bestimmte Bereiche des Proteins beschränkt bleiben.
Alle funktionell wichtigen Aminosäure-Reste, also diejenigen, die involviert
sind in Metallionen-, Membranbindung und Aktivierung, sind konserveirt. Daraus
ist zu schließen, dass alle 71 alpha-Toxine ähnlich hoch aktiv sind. Studien
von Gilbert et al (1997) zeigten, dass beta2-Toxin-Gen enthaltende C.
perfingens Stämme mit Enteritiden bei Ferkeln und Pferden assoziiert sind.
Deshalb wurden die beta2-Toxin Gene von C.perfringens-Isolaten aus erkrankten
Kaninchen ebenfalls analysiert. Die dabei angewandte Strategie entsprach der
bei der Charakterisierung der alpha-Toxin Gene verwendeten, d.h., PCR-
Amplifizierung der entsprechenden DNA-Region unter Einbeziehung strom-aufwärts
und-abwärts liegender Genregionen. Nach zum Teil experimenteller Ermittlung
der geeigneten PCR-Starter konnte gezeigt werden, dass von den 25 beta2-Toxin
Genen 16 zum sog. „Schwein“- und 9 zum „Nicht-Schwein“-Typ gehören. Alle
„Schwein“-Typ- und 5 der 9 „Nicht-Schwein“-Typ beta2-Gene wurden sequenziert.
Sie enthalten alle die für die Transkription notwendigen Promoter- und
Terminations-elemente, was darauf hinweist, dass eine monocistronische mRNA
synthetisiert wird. 15 der 16 „Schwein“-Typ beta2-Toxin Gene zeigen eine
A-Deletion innerhalb der Signalpeptid-kodierenden Region, was zu einem sehr
schnellen Translationsstop führen sollte. Nur die Probe 6 (Wallenhorst)
besitzt einen nicht unterbrochenen offenen Leserahmen, sodass erwartet werden
kann, dass hier das komplette beta2-Toxin synthetisiert wird. Dies ist das
erste Mal, dass ein „Schwein“-Typ beta2-Toxin Gen von Clostridien, die aus
Nicht-Schwein-Tieren isoloiert wurden, eine solche Charakterisitik besitzt.
Auf Grund nicht lösbarer Sequenzierprobleme konnten nur 5 der 9 „Nicht-
Schwein“-Typ beta2-Toxin Gene komplett sequenziert werden. Alle weisen einen
kompletten offenen Leserahmen auf. Ähnlich wie bei den alpha-Toxin Genen sind
die Aminosäure-Unterschiede innerhalb der Mitglieder jedes beta2-Toxin-Typs
sehr gering, allerdings deutlich zwischen Mitgliedern verschiedener beta2
-Toxin-Typen. Aus den Nukleinsäuresequenzdaten allein kann keine Voraussage
über die Synthese der beiden beta2-Toxine getroffen werden. Deshalb wurden die
Gene in den bakteriellen Expressionsvektor pASK-IBA6 kloniert. Alle drei
Toxin-Gene ließen sich als Fusionsproteine exprimieren. Dadurch bietet sich
die Möglichkeit die rekombinanten Toxine aufzureinigen und durch anschließende
Immunisierung anti-beta2-Toxin-spezifische Antikörper zu erhalten. Mit ihrer
Hilfe sollte sich das Problem der beta2-Toxin-Expression zweifelsfrei klären
lassen. Fasst man alle Sequenzdaten über die Toxin-spezifischen Gene zusammen,
so sollte auf Grund der geringen Sequenzvariabilität die Entwicklung einer
Toxoid-Vakzine gegen die Enterocolitis des Kaninchens machbar sein
