Titelblatt, Inhaltsverzeichnis, Zusammenfassung, Danksagung, Erklärung
Einleitung
Material und Methoden
Ergebnisse
Diskussion
LiteraturverzeichnisDie Duchenne Muskeldystrophie (DMD) gehört zu den häufigsten erblichen
Muskeldystrophien im Kindesalter. Gegenwärtig werden die Substitution von
Dystrophin oder ähnlichen Proteinen sowie die Korrektur der Mutation und damit
die Wiederherstellung der Dystrophinexpression als gentherapeutische
Strategien verfolgt. Jedoch führt sowohl die Herstellung der
Dystrophinexpression als auch die Verwendung von viralen Transfersystemen im
adulten Organismus zu Reaktionen des Immunsystems. Zudem wird eine autologe ex
vivo Therapie durch eine limitierte Zahl an Myoblasten eingeschränkt. Fetale
und Dystrophin-Downstream Konzepte könnten Probleme der genannten Strategien
umgehen bzw. sinnvoll unterstützen. Expressionsuntersuchungen in Dystrophin
negativen (Dys-) Muskelzellen zeigten Veränderungen in Genen für Zellwachstum
und Differenzierung. So wiesen Biopsien von DMD-Patienten ein erhöhtes Niveau
an p21 mRNA auf, einem Cyklin-abhängigen Kinase-Inhibitor, der hoch reguliert
das Fortschreiten der Zellen von der G1 zur S1 Phase im Zellzyklus und somit
die Zellteilung inhibiert. Ein erhöhtes Niveau von p21 schränkt somit die
Zielzellen für eine autologe ex vivo oder in vivo Gen- und Zelltherapie ein.
Die Reduktion von p21 würde die Möglichkeit bieten das Reservoir an Myoblasten
zu erhalten oder wiederherzustellen. In der vorliegenden Arbeit erfolgte die
Etablierung der p21 Inhibition in vitro durch RNA-Interferenz. Hierfür wurden
optimale Transfektionsbedingungen und funktionelle siRNAs ermittelt. Die
effektiven siRNAs wurden in einem lentiviralen Vektorsystem verwendet, um
einen möglichst vollständigen und stabilen p21 knockdown zu erzielen. Dies
geschah für primäre humane Myoblasten und für murine C2C12 Zellen, um den
Effekt der p21 Inhibition auf die Proliferation zu untersuchen. Die Austestung
an murinen Zellen erlaubt die Entwicklung eines Systems für einen in vivo
Versuch am mdx-Mausmodell. Zwei in humanen Myoblasten wirksame siRNAs gegen
p21 kamen an Dys- Zellen zum Einsatz. Die siRNA induzierte p21
Proteinreduktion betrug 72 Stunden nach Transfektion 29% bis 78%. Die p21
Proteinreduktion resultierte in einer Proliferationssteigerung von 11% bis 47%
gegenüber unbehandelten Kontrollen. Die Expression von siRNA im lentiviralen
Vektor führte zu einer nachhaltigen p21 Proteinreduktion von 70% fünf Wochen
nach Infektion in Zellen eines DMD Patienten. Die Proliferation der
infizierten Zellen stieg um 127%. Wiederholte Infektionen von Zellen eines
anderen Patienten zeigten einen Proliferationsanstieg von 35% bis 63%. Die
Unterschiede in der p21-Reduktion und der Proliferationssteigerung weisen auf
eine hohe Varianz des siRNA Effektes hin. Hierbei können Unterschiede im
Integrationsort des lentiviralen Vektors und individuelle Schwankungen in der
p21 Basisexpression eine Rolle spielen. Die p21 Inhibition verhinderte eine
vollständige Differenzierung. Für murine Zellen wurde ebenfalls eine siRNA
identifiziert, die nach transienter Transfektion zu einer p21 Inhibition von
61% nach 48 Stunden führte. Die abgeleitete, viral exprimierte shRNA erzielte
jedoch nur eine Reduktion von 30% gegenüber Kontrollen. Die Ergebnisse dieser
Arbeit zeigen, dass eine stabile p21 Reduktion mittels viral vermittelter RNA-
Interferenz in der Lage ist die Proliferation von Dys- Zellen zu steigen.
Damit könnte der stetige Verlust von Myoblasten bei DMD Patienten
eingeschränkt werden, was zum Erhalt der Zielzellen für eine Gen- und
Zelltherapie führt. Weiterführende Arbeiten zur Regulation der p21 siRNA
Expression müssen jedoch eine Redifferenzierung der Myoblasten sicherstellen
und sich dem Infektions-bedingten Zellverlust stellen. Während eine p21
Reduktion alleine keine Ursache für eine Onkogenese zu sein scheint, müssen
verbesserte retrovirale Systeme Integration-bedingte Risiken minimieren.Duchenne Muscle Dystrophy (DMD) is one of the most common heritable muscle
disorders in childhood. Dystrophine substitution or gene fixing approaches to
restore dystrophine expression are currently investigated as gene therapeutic
strategies. But there are still obstacles to overcome like immune response to
the re-established dystrophine expression as well to viral vector systems. And
autologous ex vivo therapies are limited due to the small amount of available
target cells. Fetal- or dystrophine-downstream concepts could bypass or assist
some problems of these strategies. Comprehensive studies on expression of
dystrophine negative (dys-) myoblasts showed altered expression of genes
involved in cell proliferation and differentiation. Biopsies of DMD patients
showed an increased level of cyclin dependent kinase inhibitor p21 mRNA
compared to dystrophine positive controls. P21 regulates the G1 S1 progression
within the cell cycle. An elevated level on p21 inhibits cell proliferation
and limits the potential target cells for an autologous ex vivo as well as in
vivo gene or cell therapy. Therefore a reduction in p21 could help to maintain
or restore the reservoir of myoblasts. In the present study a p21 inhibition
by RNA-Interference was established. Optimal transfection parameters were
determined and potent p21 siRNAs were identified. The influences on cell
proliferation were investigated. Effective siRNAs were used in a lentiviral
vector system to achieve a long lasting, inducible and complete p21 knockdown.
This was done in primary human myoblasts as well as in murine c2c12 cells.
This parallel approach provides the opportunity to use this strategy in vivo
in the mdx mouse model. Two effective siRNAs against human p21 were used on
primary dystrophine negative myoblasts. P21 protein was reduced by 29% to 79%
after 72 hours after transfection and resulted in an increase in proliferation
by 11% to 47% compared to untreated controls. The siRNA expressed by a
lentiviral vector lead to a prolonged reduction of p21 protein by 70% of
myoblasts from a dys- patient five weeks after infection. The proliferation
was elevated by 127%. Infection of myoblasts from a second patient resulted in
a protein reduction by 35%-63%. The p21 knockdown prevented also a complete
differentiation of myoblasts. Differences in p21 basis expression, or
different integration sites of the lentiviral vector could be the reason for
observed variances in the effect of siRNA inhibition. The p21 knockdown
prevented also a complete differentiation of myoblasts. Additionally effective
siRNAs for tests on murine myoblasts were identified. After transient
transfection p21 protein was reduced by 61% after 48 hours. The same siRNA
expressed by a lentiviral vector showed a decrease of p21 protein by only 30%
compared to untreated controls. Differences in p21 basis expression, or
different integration sites of the lentiviral vector could be a reason for the
observed variances in the effect of siRNA inhibition. The present study shows
that a stable p21 inhibition by RNA interference can lead to an increased
proliferation of dys- myoblasts. This could prevent the continuous loss of
myoblasts and preserve cells for an additional gene and cell therapy.
Following studies which focus on regulation of siRNA expression should assure
redifferentiation of treated myoblasts. Although the loss of p21 alone seemed
no cause of oncogenesis, retroviral vector systems have to be improved to
minimize the risk of oncogenesis by random integration
