Effects of raf kinase inhibitor protein on neuronal differentiation and its role in ethanol-impaired neuronal development of human SH-SY5Y neuroblastoma cells

Abstract

Für die Entwicklung und Integrität des Nervensystems stellt die neuronale Differenzierung einen wichtigen Prozess dar, welcher gegenüber schädlichen Umwelteinflüssen wie Alkoholexposition zeitlebens vulnerabel ist. Zur Untersuchung neuronaler Differenzierung zugrunde liegender Prozesse wurde ein humanes, neuronales Zellkulturmodell etabliert. Es wurde auf Ebene der Zellmorphologie, der intrazellulären Signaltransduktion sowie der Expression neuronaler Markerproteine und signaltransduktions-assoziierter Proteine analysiert sowie hinsichtlich dopaminerger Eigenschaften charakterisiert. Insbesondere das Raf kinase inhibitor protein (RKIP), ein möglicherweise auch an der neuronalen Signaltransduktion modulierend beteiligtes Protein, und die Proteinkinase C (PKC) wurden hinsichtlich möglicher Beteiligung an neuronaler Differenzierung sowie ethanolbedingten Differenzierungsschäden untersucht. Hierzu wurden humane Neuroblastomzellen mit Retinsäure bis zu 4 Wochen differenziert, mit Ethanol behandelt und Analysen mittels Phasenkontraszmikroskopie, Immunzytochemie, Western Blot, cAMP-spezifischem ELISA, quantitativer RT-PCR sowie Hochdruck-Flüssig¬keitschromatographie durchgeführt. Weiterhin wurde eine eigene, unabhängig von Ethanoleinflüssen bestehenden Rolle des RKIP bei der neuronalen Differenzierung untersucht. Hierzu wurde RKIP mittels gezielter Transfektion überexprimiert und downreguliert. Unter Ethanolexposition zeigte sich morphologisch eine beeinträchtigte Differenzierung. Entsprechend fanden sich auch im Quotienten der mRNA des prä- und postsynaptischen Dopaminrezeptors eine Störung des differenzierungstypischen Verteilungsmusters sowie eine reduzierte Expression neuronaler Markerproteine. Zudem ergab sich eine signifikant reduzierte Aktivierbarkeit der Mitogen aktivierten Proteinkinase-Kaskade, welche Effekte differenzierungsfördernder Substanzen wie bspw. Brain derived neurotrophic factor (BDNF) vermittelt. Gleichzeitig lag eine signifikant reduzierte PKC- und RKIP-Expression vor. Die Ergebnisse zu ethanolbedingter Reduktion relevanter neuronaler Proteine sowie der assoziierten Signaltransduktion zeigen einerseits allgemeine Mechanismen zellulärer Toleranzentwicklung auf und geben andererseits Aufschluss über Mechanismen der daraus resultierenden Differenzierungsschäden, wie sie bspw. auch in der Maximalvariante am Phänotyp der Alkoholembryopathie beobachtet werden. In Transfektionsexperimenten konnte darüber hinaus erstmals eine eigene Rolle des RKIP in der neuronalen Differenzierung belegt werden: Während die Überexpression von RKIP in verstärkter Signaltransduktion und schließlich beschleunigter neuronaler Differenzierung resultierte, ergab sich nach Downregulation ein glialer Phänotyp bei reduzierter neuronaler Differenzie¬rung.Neuronal differentiation represents a hallmark in neuronal development and has repeatedly been discussed to be altered in several psychiatric conditions. The signal transduction underlying neuronal differentiation is tightly regulated by a variety of proteins, including Raf kinase inhibitor protein (RKIP), which acts as a molecular switch amplifying neurotrophin-mediated signal transduction. Several aspects of RKIP-modulated signal transduction are affected by ethanol exposure. To elucidate the role of the signal transduction modulator RKIP in ethanol-impaired neuronal development and in neuronal differentiation, a human neuronal cell culture model was established including conditions of RKIP overexperssion and gene silencing. Aspects of cellular morphology, intracellular signal transduction mechanisms involving RKIP and the protein kinase C (PKC) and expression of select marker proteins were quantitatively analyzed. Moreover, aspects of dopaminergic differentiation were investigated by high pressure liquid chromatography (HPLC). Ethanol exposure resulted in significantly impaired neuronal differentiation, which was attributable to impaired signal transduction due to reduced RKIP and PKC expression. Transfection studies additionally revealed a role for RKIP in neuronal differentiation. While RKIP overexpression significantly enhanced neuronal differentiation, RKIP knock-down resulted in a glial-like phenotype with impaired neurite outgrowth accompanied by a significant increase in glial marker protein expression. These results suggest a role for RKIP in regulating neuronal differentiation, possibly at the level of fate-determination