In this thesis, the overall goal was to develop novel stimuli-responsive
nanocarriers which are able to overcome biological barriers and furtherly
transport and release various therapeutic cargos to the target site.
Furthermore, the aim was to develop a nanomedicine platform that shows the
ability to protect the sensitive cargo and use natural stimuli for a
controlled release. Besides therapy, the tailor-made nanocarriers are targeted
to be adaptable for diagnostic approaches. In the first project of this
thesis, a pH degradable dPG-amine nanocarrier for the delivery of genetic
material was developed. Due to the introduction of stimuli-responsive acetal
groups the nanocarrier could be cleaved at acidic pH values which occur in the
endosomal compartments and remained stable at neutral pH which appearrs in the
extracellular matrix. Modified benzacetal moieties realized a fine-tune in the
cleavage kinetics. The complexation and release of DNA out of nanocarriers was
studied by various methods. The pH triggered cleavage of the outer amine shell
results in the degradation of the multivalent amine architecture. By that, the
ability to bind genetic material is reduced and a controlled release of DNA
can occur. In vitro transfection demonstrated that pH cleavable dPG-amines
could transfect HeLa cells with GFP-DNA and resulted in cell-compatible
cleavage products with a significantly reduced toxicity compared to the non-
degradable gold standard PEI. The synthesis of these degradable core-shell
polymers realizes a new carrier platform for the complexation and controlled
release of genetic material at the target site by the loss of multivalent
interactions. Additionally, a novel approach for the synthesis of dendritic
polyglycerol based nanogels was developed. The Thiol–Michael nanoprecipitation
method which operates under mild conditions and did not require any catalyst
or surfactant was used to develop tailor-made nanogels in the size range of
100-1000 nm. The biocompatible nanogels were used for diagnostic as well as
therapy for topical skin application. Dye-labeled nanogels were used for the
first time as pH-nanosensors to determine the pH of the hair follicle (HF) at
different depth in an ex vivo porcine ear model. The non-toxic nanogels showed
a high potential for the penetration via the follicular uptake route. An
automated analysis of confocal laser scanning microscopy (CLSM) images helped
to accurately determine the pH inside the HF. The pH gradient ranged from 6.5
on the skin surface to 7.4 in deeper areas of the HF with a sharp pH increase
over the first 300 μm. This finding provides a clear direction for the
development of pH responsive DDS for follicular drug delivery. Furthermore,
functional nanogel-peptide conjugates were developed which could complex and
release hydrophobic drugs into the skin. The conjugation of the tailor-made
peptide chains to the polyglycerol based nanogel increased the loading
capacity and binding specificity of the targeted therapeutic model drug
significantly. Skin penetration tests showed efficient dermal delivery and
release of a photosensitizer which can be used for photo-dynamic therapy
against cancer. Moreover, cationic nanogels based on dendritic polyglycerol
and low molecular weight PEI were used for the delivery of siRNA. The genetic
material could be encapsulated by the above-mentioned Thiol-Michael
nanoprecipitation. The mild and bioorthogonal reaction enables the in-situ
binding of GFP-siRNA into the nanogel matrix. Acetal moieties which were
incorporated inside the nanogel realize a pH dependent degradation of the
sub-100 nm carrier. In vitro transfection demonstrated that the pH cleavable
nanogels could successfully silence GFP processing HeLa cells and were
significantly less toxic compared to non-cleavable PEI. The cationic nanogel-
platform will be investigated further for the delivery of anti-inflammatory
siRNA for topical skin application. Additionally, formation and impact of the
protein corona on the dPG-based nanogels with a varied surface charge was
analyzed. Here, nanogels with a higher surface charge showed an increased
binding of the blood protein human serum albumin (HSA) which resulted in an
increased hydrodynamic radius and reduced surface charge. In the future, the
nanogel manufacturing process could be upscaled to produce nanocarriers with a
standard operation protocol in a one batch procedure to ensure further
development to a nanomedicine platform. Recently, nanoparticles were prepared
by nanoprecipitation process in a microfluidic device.[219] In general, this
technique is used for the production of microparticles[220] which are useful
for advanced drug delivery (e.g. the encapsulation of biological cargos like
living cells[221]) and may be adapted to produce stimuli responsive nanogels
in a continuous process in high quantity. Furthermore, the nanogel-platform
could be used to encapsulate various therapeutic proteins or therapeutic
hydrophobic drugs. Due to the flexible nanogel size range the application area
is widely spread. Smaller nanogels in the sub-100 nm area could be used for
the intracellular delivery of encapsulated therapeutic cargo. In contrast,
bigger nanogels could be applied to transport their freight into deeper areas
of the hair follicle for therapeutic dermal applications. Incorporated
stimuli-responsive groups would realize a controlled release and the
degradation to biocompatible residues.Das übergeordnete Ziel dieser Arbeit war es neuartige Stimulus empfängliche
Nanotransporter zu entwickeln, die biologische Barrieren überwinden und
zusätzlich therapeutische Fracht transportieren und freisetzen können.
Weiterhin sollte eine nano-medizinische Plattform hergestellt werden, der es
möglich ist die sensible Fracht zu schützen und durch natürliche Stimuli
kontrolliert am Zielort freizugeben. Neben therapeutischen Aspekten sollen die
maßgeschneiderten Nanotransporter auch für diagnostische Ansätze genutzt
werden. Im ersten Projekt dieser Thesis wurde ein pH spaltbarer
Nanotransporter entwickelt, der genetisches Material befördern kann. Auf Basis
der Einführung von Stimulus empfänglichen Acetalgruppen kann der
Nanotransporter in saurem pH Milieu gespalten werden. Diese treten in den
endosomalen Kompartimenten auf und bleiben bei neutralem pH-Wert, wie er in
einer extrazellularen Matrix auftritt, stabil. Modifizierte Benzacetal-gruppen
ermöglichen dabei einen Feinschliff der Spaltkinetik. Die Komplexierung und
die Freisetzung der DNA aus Nanotransportern wurde mit verschiedenen Ansätzen
analysiert. Die pH-getriggerte Spaltung der äußeren Aminschale resultiert in
einem Zerfall der multivalenten Amin-Architektur. Aufgrund dessen ist die
Fähigkeit der Bindung von genetischen Material reduziert. Dies ermöglicht eine
kotrollierte Freisetzung der DNA. Mit Hilfe von in vitro Transfektions-Tests
konnte gezeigt werden, dass pH-spaltbare dPG-Amine HeLa Zellen mit GFP-DNA
transfizieren können. Die Spaltprodukte des Nanotransporters weisen im
Vergleich zum abbauresistenten Goldstandard PEI eine signifikant reduzierte
Toxizität auf. Die Synthese dieser spaltbaren Kern-Schale-Polymere ermöglicht
eine neue Transportplattform für die Komplexierung sowie kontrollierter
Freisetzung von genetischem Material, die durch den Verlust multivalenter
Interaktionen genau am Zielort greifen kann. Zusätzlich wurde ein neuer Ansatz
für die Synthese von Nanogelen entwickelt, die auf dendritischen Polyglycerin
basieren. Die Methode der Thiol-Michael Nanofällung, die unter milden
Reaktionsbedingungen durchgeführt wurde, benötigt weder einen Katalysator noch
Tenside, um maßgefertigte Nanogele im Größenbereich von 100-1000 nm
herzustellen. Die biokompatiblen Nanogele wurden sowohl für die Diagnostik als
auch für topische Hautanwendungen benutzt. Zum ersten Mal wurden
farbstoffmarkierte Nanogele als pH-Nanonsensoren genutzt, um den pH-Wert von
Haarfollikeln (HF) in verschiedenen Tiefen in einem ex vivo Schweineohrmodell
zu bestimmen. Die nicht-toxischen Nanogele wiesen ein hohes Potenzial für das
Eindringungsvermögen über den follikulären Aufnahmeweg auf. Mit Hilfe einer
automatisierten Analyse durch konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie konnte der
pH-Wert innerhalb des HFs genau bestimmt werden. Der pH Gradient erstreckte
sich von Werten von 6,5 auf der Hautoberfläche bis hin zu Werten von 7,4 in
tieferen Arealen des HFs mit einem starken pH-Anstieg über die ersten 300 µm.
Diese Erkenntnis gibt eine klare Richtung für die Entwicklung von pH-
responsiven DDS für den follikulären Wirkstofftransport. Weiterhin wurden
funktionelle Nanogel-Peptid Konjugate entwickelt, die hydrophobe Wirkstoffe
komplexieren und in der Haut freigeben können. Die Konjugation der
maßgeschneiderten Peptidketten an Polyglycerin basierten Nanogelen konnte die
Ladungskapazität sowie die Bindungsspezifität im anvisierten therapeutischen
Modell-wirkstoff signifikant erhöhen. Tests zur Hautpenetration zeigten einen
effizienten dermalen Wirkstofftransport sowie die Freigabe eines Photo-
Sensibilisators der in der photo-dynamischen Krebstherapie eingesetzt werden
kann. Darüber hinaus wurden kationische Nanogele, basierend auf dendritischen
Polyglycerin und niedermolekularem PEI, für den Transport von siRNA verwendet.
Das genetische Material wurde dabei durch die oben bereits erwähnte Thiol-
Michael Reaktion eingekapselt. Die milde, bioorthogonale Reaktion befähigt die
in situ Bindung von GFP-siRNA in die Nanogelmatrix. Mittels Acetalgruppen, die
in das Nanogel eingebettet wurden, konnte ein pH-abhängiger Abbau der sub-100
nm Träger realisiert werden. Mittels in vitro Transfektion wurde gezeigt, dass
pH-spaltbare Nanogele erfolgreich die GFP Bildung von HeLa Zellen unterdrücken
können. Zusätzlich zeigten sich diese als weniger toxisch verglichen mit
nichtspaltbarem PEI. Die kationische Nanogelplattform wird weiter für den
Transport anti-entzündlicher siRNA für topische Hautanwendungen untersucht
werden. Zusätzlich wurde die Bildung sowie der Einfluss der Proteinkorona auf
dPG-basierte Nanogele mit unterschiedlichen Oberflächenladungen untersucht.
Dabei zeigte sich, dass Nanogele mit einer höheren Oberflächenladung eine
erhöhte Bindung des Blutproteins Humanalbumin aufweisen. Dies resultierte in
einem erhöhten hydrodynamischen Radius sowie einer reduzierten
Oberflächenladung des Nanogels. In Zukunft wäre ein Upscale des
Herstellungsprozesses von Nanogelen denkbar, um Nanotransporter mittels eines
Standardprotokolls in einer ein-Batch Prozedur herzustellen, um die
Entwicklung zu einer nanomedizinischen Plattform zu ermöglichen. Erst kürzlich
wurden Nanopartikel im Nanofällungsprozess mittels Mikrofluidik
hergestellt.[219] Generell wird diese Technik für die Produktion von
Mikropartikeln benutzt.[220] Diese sind besonders für die Anwendung des
fortgeschrittenen Wirkstofftransports (z.B. die Einkapselung von biologischer
Fracht wie lebenden Zellen[221]) nützlich. Außerdem besteht die Möglichkeit
dieses Verfahren zu adaptieren, um Stimuli-sensitive Nanogele in einem
kontinuierlichen Prozess in hohen Mengen herzustellen. Weiterhin ist es
möglich die Nanogelplattform zu nutzen, um verschiedene therapeutische
Proteine oder hydrophobe Wirkstoffe einzukapseln. Aufgrund des weiten
Größenbereichs der Nanogele ist das Anwendungsspektrum sehr breit. Kleinere
Nanogele im sub-100 nm Bereich könnten für den intrazellulären Transport eines
eingekapselten therapeutischen Wirkstoffes genutzt werden. Im Gegensatz dazu
könnten größere Nanogele dazu genutzt werden, um ihre Fracht in tiefere Areale
des Haarfollikels für therapeutische dermale Anwendungen zu transportieren. In
das Nanogel eingebaute, Stimuli-sensitive Gruppen würden eine kontrollierte
Freigabe und die Zersetzung zu biokompatiblen Abbauprodukten realisieren
