Titel und Inhaltsverzeichnis
1 EINLEITUNG
2 MATERIAL UND METHODEN
3 ERGEBNISSE
4 DISKUSSION
5 ZUSAMMENFASSUNG
6 SUMMARY
7 LITERATURVERZEICHNISDer fakultativ humanpathogene Pilz C. albicans besiedelt als harmloser
Kommensale Haut und Schleimhäute des Menschen. Als Pathogen spielt C. albicans
als Erreger von oralen Candidosen vor allem bei immunsupprimierten Patienten
eine wichtige Rolle. Kommt es zu Veränderungen der lokalen Mikroflora oder zu
Abschwächungen des Immunsystems, wie es z.B. bei HIV+ Patienten der Fall ist,
kann es zu oralen Infektionen durch C. albicans kommen. Diese manifestieren
sich durch eine massenhafte Vermehrung der Pilzzellen sowie der Invasion in
oberflächennahe Bereiche des Epithelgewebes. Die zellulären und molekularen
Mechanismen der Interaktionen von C. albicans während der Kolonisierung oder
der Infektion des oralen Epithelgewebes sind dabei noch weitgehend unklar. Um
die komplexen Vorgänge der Wirt-Pathogen Interaktionen während der Infektion
zu untersuchen, wurde eine experimentelle Infektion durchgeführt und
analysiert. Dazu wurde ein in vitro generiertes orales Epithelgewebe (RHE) mit
C. albicans infiziert und zu verschiedenen Zeitpunkten mikroskopisch
analysiert. Basierend auf der mikroskopischen Analyse wurde die experimentelle
Infektion in drei Phasen unterteilt: eine frühe Adhäsionsphase (1 h), eine
mittlere, invasive Phase (3-6 h) und eine späte Phase (12-24 h), welche durch
eine starke Schädigung des epithelialen Gewebes gekennzeichnet war. Die frühe
Phase der Interaktion war charakterisiert durch eine unmittelbare Induktion
der Hyphenbildung sowie einer starken Adhäsion der Pilzzellen an das
epitheliale Gewebe. Analysen der elektronenmikroskopischen Aufnahmen (REM,
TEM) zeigten weiterhin, dass die Invasion der C. albicans Hyphenzellen in das
Gewebe dabei sowohl über passive Mechanismen (induzierte Endozytose) als auch
über aktive Mechanismen (aktive Penetration) stattfand. Die späte Phase der
experimentellen Infektion war charakterisiert durch ein dichtes Myzelgeflecht,
welches sich invasiv im Gewebe ausbreitete und zu einer starken Schädigung des
Gewebes führte. Basierend auf den mikroskopischen Untersuchungen erfolgte
weiterführend die molekulare Analyse der Interaktionen. Dazu wurden das orale
Epithelgewebe über verschiedene Zeitpunkte (1, 3, 6, 12 und 24 h) mit C.
albicans infiziert und die Proben mit C. albicans spezifischen Mikroarrays
hybridisiert. Um die Relevanz der Daten aus den experimentellen Infektionen zu
überprüfen, wurden Mikroarray-Experimente mit in vivo isolierten
Patientenproben durchgeführt und die erstellten Transkriptionsprofile mit den
Transkriptionsprofilen der in vitro Infektionen verglichen. Trotzdem die
Transkriptionsprofile der elf Patientenproben eine unerwartet starke
Heterogenität aufwiesen, konnte eine Reihe von Genen identifiziert werden,
welche sowohl in den in vitro als auch den in vivo Proben ähnlich reguliert
waren. In dieser Gruppe waren Gene, welche mit dem Hefe/Myzel Übergang, einer
adaptiven Anpassung an ein neutrales pH-Milieu, mit der Verwertung
verschiedener Kohlenstoff-Quellen sowie der Bekämpfung von nitrosativem Stress
assoziiert waren. Ein weiteres Ziel der Analyse der in vivo und in vitro
erstellten Transkriptionsprofile war es, Gene zu identifizieren, welche
möglicherweise mit der Virulenz von C. albicans assoziiert sind. Dazu wurden
acht Gene ausgewählt, welche stark und spezifisch während der frühen oder der
späten Phase der experimentellen Infektion sowie in den Patientenproben
exprimierte waren. Diese wurden in C. albicans ausgeschaltet und die
erstellten Mutantenstämme weiterführend analysiert. Bei der Analyse der
Interaktion der erstellten Mutanten mit dem RHE-Modell waren vier der Mutanten
leicht bis stark attenuiert in den Fähigkeiten, Gewebeschädigungen zu
induzieren. Eine Mutante, in welcher das Gen EED1 ausgeschaltet worden war,
zeigte einen nahezu avirulenten Phänotyp. Das Gen EED1, welches sowohl in den
Patientenproben als auch während der experimentellen Infektion eine starke
Expression gezeigt hatte, stellte sich weiterhin als essentiell für die
Hyphenbildung in C. albicans heraus. Delta-eed1 Mutanten waren gekennzeichnet
durch eine lediglich transiente Hyphenbildung und einem daraus resultierenden,
auf oberflächliche Gewebebereiche begrenzten, invasiven Wachstum. Die
weiterführende Proliferation der Delta-eed1 Mutante fand in den Epithelzellen
und -gewebe dabei nur noch in der Hefeform statt, so dass keine invasive
Ausbreitung mehr im Gewebe stattfinden konnte. Die in dieser Arbeit gewonnen
Ergebnisse zeigen, dass die Hyphenmorphologie sowie die adaptive Interaktion
der C. albicans Zellen mit dem Epithelgewebe eine wichtige Rolle bei der
Initiation und der Etablierung einer oralen Infektion spielen.Candida albicans is normally a harmless commensal fungus of mucosal surfaces
in healthy individuals but can cause several types of infections in
predisposed patients, ranging from superficial to life-threatening disease. As
the most common oral fungal pathogen of humans, C. albicans frequently causes
oral infections in human immunodeficiency virus (HIV)-infected patients.
During oral infections, fungal cells invade the oral mucosa and persist within
the epithelium causing superficial lesions. However, the mechanisms by which
C. albicans invades and persists within mucosal epithelium are not clear. To
understand oral pathogenesis, cellular and molecular mechanisms of epithelial-
fungus interactions were characterized using a model based on reconstituted
human oral epithelial tissue (RHE). Based on the microscopical analysis of
histological sections the experimental infection process was dissected into
three different phases: an early attachment phase (1 h), a mid-invasion phase
(3-6 h) and a late destruction phase (12 24 h). The early attachment phase was
characterized by immediate hyphal formation and a strong adhesion of the
fungal cells to the epithelial tissue. Furthermore, electron microscopy (SEM,
TEM) revealed that hyphal formation facilitates epithelial invasion via both
active (physical penetration) and passive (induced endocytosis) processes. The
late phase was characterized by a dense network of hyphal cells invading and
disseminating within the tissue. Only the late phase was correlated with
strong tissue damage, reflected by the release of an epithelial marker enzyme
(LDH). Based on these observations genome-wide transcript profiling of C.
albicans was performed at five time-points (1, 3, 6, 12 and 24 h) aiming to
identify phase-specific genes. To show that the data obtained from the in
vitro infection model reflect the in vivo situation, transcriptional profiling
of C. albicans cells isolated from patients suffering from oral Candida
infections was also analyzed. Although the transcriptional profiles of the 11
patient samples showed an unexpected high heterogeneity, a set of genes was
identified which were similarly regulated under in vitro and in vivo
conditions. The expression profiles reflected the morphological switch and an
adaptive response to neutral pH, non-glucose carbon sources and nitrosative
stress. To identify genes, potentially associated with fungal virulence, eight
genes were targeted to create knock-out mutants. Thereby only genes whose
expression was phase-specific and/or expressed in both patients and the RHE
model were chosen. All eight mutants were analyzed in the RHE model and under
a number of in vitro growth conditions. Four of the mutants had moderate or
strongly reduced abilities to damage epithelial tissue. One gene, up-regulated
in both RHE infection and patients, named EED1, was essential for maintenance
of hyphal elongation. Mutants lacking EED1 showed transient cell elongation on
epithelial tissue, which enabled only superficial invasion of epithelial
cells. Once inside an epithelial cell, delta-eed1 cells could proliferate as
yeasts or pseudohyphae but remained trapped intracellular. These results
suggest that the adaptive response and morphology of C. albicans play specific
roles for host-fungal interactions during mucosal infections
