Titelblatt und Inhaltsverzeichnis
Einführung in die Thematik
Übersicht der eigenen Untersuchungen
Zusammenfassung der Ergebnisse
Zusammenfassung
Literatur
Abkürzungen
Danksagung
Eidesstattliche Versicherung
Publizierte Forschungsergebnisse dieser ArbeitDie Senkung der Inzidenz des Atemnotsyndroms durch die pränatale Lungen-rei-
feinduktion und die deutlich verringerte Letalität des Atemnotsyndroms seit
Einführung der Surfactant-Therapie haben in erheblichem Umfang zur Abnahme der
Säuglings-sterblich-keit beigetragen. Die Fortschritte innerhalb der letzten
Jahre sind hinsichtlich der Co-Morbidität des Atemnotsyndroms allerdings
deutlich geringer als in den Jahren vor 1990. Bei der Induktion der pränatalen
Lungenreife wurde die Bedeutung der langketti-gen Fettsäuren (LCFA) als
Substrat der Surfactantlipidsynthese nur am Rande unter-sucht. Mit dem Ziel,
die körpereigene Surfactantbildung während der foetalen und/oder neonatalen
Entwicklung gezielt zu steigern, haben wir Regulationsmechanismen der de novo
Phosphatidylcholin-Synthese in Typ II Zellen untersucht. Der Schwerpunkt
unserer Arbeit lag auf der Charakterisierung der Aufnahme von Palmitinsäure
durch Typ II Zellen, da durch die ausreichende Bereitstellung dieses
Substrates eine Steigerung der Surfac-tantlipidsynthese erzielbar ist. Zu
Beginn unserer Untersuchungen wurde der Transport von LCFA durch die
Zellmembran grundsätzlich kontrovers � passiv vs. proteinvermittelt -
diskutiert. Wir untersuchten deshalb zunächst den transmembranären Transport
von Palmitat hinsichtlich seiner Kinetik und Energieabhängigkeit und zeigten,
daß FAT/CD36 für etwa 70 % der Palmitataufnahme isolierter Typ II Zellen
verantwortlich ist. Die Palmitat-auf-nahme wird nicht über "coated pits",
sondern über Caveolae-ähnliche Strukturen der Typ II Zellmembran, sogenannten
DIGs, vermittelt. Durch Manipulation des zellulären Chole-sterolgehaltes
gelang es uns, FAT/CD36 in DIGs anzureichern und dabei die Palmitatauf-nahme
drastisch zu steigern. Die an FAT/CD36 gebundene Palmitinsäure braucht einen
Lösungsvermittler um in das Cytosol zu gelangen. FABPs sind cytosolische
Proteine, die die Lösung der LCFA vermitteln können. Folgerichtig ist die
Palmitat-aufnahme und Phosphatidycholin-Synthese in Typ II Zellen von
H-/E-FABP double knock out-Tieren verringert. Wird die Expression von FAT/CD36
und Caveolin-1 durch den PPARgamma-Aktivator Pioglitazon erhöht, steigen
Palmitataufnahme und Phosphatidycholin-Synthese wieder auf das Niveau des
Wildtypes. Die Kompensation des FABP-knock-out Effektes durch Pioglitazon
beruht sehr wahrscheinlich auf einer Interaktion von Caveolin-1 und PPARgamma,
die wir erstmals nachweisen konnten. Kürzlich wurde beschrieben, daß sich
Vesikel, die Caveolin-1 enthalten, abschnüren und möglicherweise LCFA wie
FABPs durch das Cytosol transportieren können. Diese und die von anderen
Arbeitsgruppen gewonnenen Daten zeigen klar, daß membranständigen
Fettsäuretransportern - hier FAT/CD36 - eine wichtige Rolle bei der
Fettsäureaufnahme zukommt und daß die Zelle über verschiedene Mechanismen der
Regulation der Palmitataufnahme verfügt. Die Beschleunigung der initialen
Palmitatauf-nahme in Typ II Zellen geht mit einer Steigerung der
Phosphatidylcholin-Synthese einher, die wahrscheinlich durch eine Aktivierung
der Cytidylyltransferase vermittelt wird. Es ist aber auch denkbar, daß das
vermehrte intrazelluläre Angebot an Fettsäure die Glycerin-3-phosphat
Acyltransferase stimuliert, die ebenfalls geschwindigkeitsbestimmend bei der
Phosphatidylcholin-Synthese sein kann. Wir konnten zeigen, daß Vitamin
E-Depletion die Aktivität der Glycerin-3-phosphat Acyltransferase und die
Synthese von Phosphatidyl-cholin in Typ II Zellen senkt. Die Oxidation von
funktionellen SH-Gruppen des Enzyms bei Vitamin E-Mangel hemmt seine
Aktivität. Es ist bekannt, daß die verringerte Phosphati-dylcholin-Synthese in
Typ II Zellen unter Ozon mit einer isolierten Hemmung der Glycerin-3-phosphat
Acyltransferase einhergeht. Die Kombination beider Faktoren, Vitamin E-Mangel
und oxidative Belastung der Typ II Zelle, ist klinisch, vor allem bei unreifen
Neugeborenen, relevant und beeinträchtigt sehr wahrscheinlich die
Phosphatidylcholin-Synthese. Nach unserer Kenntnis ist der Effekt von Vitamin
E auf die Inzidenz oder den Schweregrad des Atemnotsyndroms nicht untersucht.
Ob unsere tierexperimentell gewonnenen Daten zur Phosphatidylcholin-Synthese
bei Vitamin E-Mangel von klinischer Relevanz sind, läßt sich daher gegenwärtig
nicht abschätzen.Considering the mechanisms by which antenatal maturation of lung can be
induced, the role of long chain fatty acids as precursors of surfactant lipid
synthesis has not been thoroughly investigated. To specifically increase
surfactant synthesis during the fetal and/or neonatal period we studied the
regulation of de novo phosphatidyl synthesis in type II pneumocytes. First, we
characterised the transmembrane transport of palmitate, a long chain fatty
acid prevalent in surfactant lipids, with regard to its kinetic and energy
dependence and showed that FAT/CD36 facilitates around 70 % of palmitate
uptake into type II pneumocytes. Palmitate uptake does not depend on coated
pits but is mediated by membrane structures which are similar to caveolae, so
called DIGs. Increase of cellular concentration of cholesterol caused a
significant enrichment of FAT/CD36 in DIGs of type II cells which was
accompanied by a drastically enhanced palmitate uptake. Once inside the cell,
palmitate is bound to members of the family of fatty acid binding proteins
(FABP). We identified two members, the epidermal (E-) and the heart (H-) type
FABP in type II cells. Based on the assumption that E-FABP and H-FABP in
alveolar type II cells mediate the synthesis of dipalmitoyl
phosphatidylcholine, the main surfactant phospholipid, we analysed TII cells
isolated from wild type (wt) and E/H-FABP double-knock out (double-ko) mice.
Application of labelled palmitic acid to these cells revealed a drop in
uptake, β-oxidation, and incorporation into neutral lipids and total
phosphatidylcholines of TII cells from double-ko mice. Whereas incorporation
of labelled palmitic acid into DPPC remained unchanged, degradation studies
demonstrated a substantial shift in DPPC synthesis from de novo to
reacylation. In addition, increased expression of mRNAs encoding fatty acid
translocase (FAT), caveolin-1 and PPARγwas observed in the double-ko
phenotype. As caveolin-1 interacted with PPARγ we assumed that FAT,
caveolin-1, and PPARγ form a signalling chain for fatty acid or drug.
Consequently, PPARγ-selective pioglitazone was added to the diet of double-ko
mice. We found that further activation of PPARγ could �heal� the E/H-FABP
double-ko effect in these TII cells as transport and utilisation of labelled
palmitic acid restored a wt phenocopy. This indicated that E-FABP and/or
H-FABP are involved in the mediation of DPPC synthesis in wt TII cells. These
data and data obtained by other groups clearly indicate that membrane-bound
fatty acid carriers, e.g. FAT/CD36, play an important role in long chain fatty
acid uptake and that mammalian cells possess different mechanisms to regulate
palmitate uptake. Increase of palmitate uptake is paralleled by an increased
phosphatidylcholine synthesis, probably mediated by activation of cytidylyl
transferase
