Esophageal cancer has long been considered one of the deadliest malignancies
and considerable controversy has surrounded its management. Esophageal cancer
patients have a dismal prognosis, because of the late presentation of patients
with this disease and the technical difficulty of an adequate surgical
resection in the presence of advanced local and regional involvement. The most
common histological type is esophageal squamous cell carcinoma (ESCC), which
is distributed throughout the length of the esophagus. In order to achieve a
more tailored therapy and, consequently, improved prognosis, we studied gene
expression profiles of ESCC in comparison to that of normal esophageal
squamous epithelium with the aim of characterizing the changes in gene
expression that underlie ESCC progression. Laser capture microdissection of
frozen specimens in collaboration with an experienced pathologist was applied
to collect the cells from well-defined tumor areas. Whole human gene
expression profiling of ESCC specimens (n=10) and normal esophageal squamous
tissue (n=18) was performed using microarray technology. Microarray results
were validated by quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR)
in a second and independent cohort (n=71) consisting of ESCC (n=25), normal
esophagus (n=11), esophageal adenocarcinoma (n=13), gastric adenocarcinoma
(n=15) and colorectal cancers (n=7). In order to understand the functional
relevance of a newly identified marker gene, siRNA-mediated knockdown was
performed in a human esophageal squamous cell carcinoma cell line, KYSE520,
and the effects of this treatment were checked by another microarray analysis.
A gene encoding WDR66, WD repeat-containing protein 66, was found whose
expression was significantly high in ESCC specimens (P < 0.0001). High WDR66
expression was significantly associated with poor overall survival (P = 0.031)
of patients suffering from ESCC. Multivariate Cox regression analysis revealed
that WDR66 expression remained an independent prognostic factor (P = 0.042).
WDR66 knockdown by RNA interference resulted particularly in changes of the
expression of membrane components. This was validated by qRT-PCR and western
blotting experiments in the human squamous cell carcinoma cell line KYSE520,
providing independent evidence of the changes of Vimentin (VIM) and occluding
(OCLN) expression associated with the WDR66 knockdown. Gene expression level
of VIM was significantly down-regulated whereas OCLN expression was
significantly higher in cells treated with WDR66 siRNA by qRT-PCR (VIM, P =
0.0286; OCLN, P = 0.0186). Detection of VIM and OLCN protein by immunoblotting
showed that VIM expression was significantly down-regulated while the
expression of OCLN was significantly higher in KYSE520 cells treated with
WDR66 siRNA. Interestingly, VIM was highly expressed (P = 0.0008) while OCLN
was less expressed (P < 0.0001) in ESCC specimens in comparison to normal
esophagus. This may underline a central role of WDR66 for ESCC development.
Furthermore, siRNA-mediated knockdown of WDR66 resulted in suppression of cell
growth, reduced cancer cell motility and enhanced cancer cell apoptosis after
addition of Staurosporine and 5-Fluorouracil. According to these studies,
WDR66 might be a useful biomarker for risk stratification of ESCC. As a
positive modulator of epithelial-mesenchymal transition, WDR66 expression is
likely to play an important role in ESCC growth and invasion. Moreover, our
functional studies point toward an important role of WDR66 for squamous
carcinoma cell growth and motility. In the future, WDR66 might become a novel
drug target for the treatment of esophageal squamous cell carcinoma.Karzinome der Speiseröhre werden schon lange als besonders gefährlich für den
Patienten und ihre Behandlung wird weiterhin kontrovers diskutiert. Aufgrund
der späten Vorstellung von Patienten mit dieser Krankheit und der technischen
Schwierigkeit einer adäquaten chirurgischen Resektion bei Vorliegen von
erweiterten lokalen und regionalen Rezidiven haben Patienten mit Karzinomen
der Speiseröhre eine schlechte Prognose. Das häufigste Karzinom der
Speiseröhre ist das Plattenepithelkarzinom des Ösophagus, dessen Verteilung
sich über die gesamte Länge der Speiseröhre erstreckt. Um eine
maßgeschneiderte Therapie und damit verbesserte Prognose zu erreichen, suchten
wir hier nach Genen mit erhöhter Expression in Plattenepithelkarzinomen des
Ösophagus. Dazu untersuchten wir die Genexpressionsprofile von
Plattenepithelkarzinomen des Ösophagus im Vergleich zu normalem Ösophagus
Plattenepithel. Die Laser-Mikrodissektion von gefrorenem Probenmaterial wurde
angewandt, um in Zusammenarbeit mit einem erfahrenen Pathologen (Prof. Michael
Vieth, Universität Bayreuth) nur Zellen aus wohldefinierten Tumorbereichen für
die Untersuchung zu selektieren. Unter Verwendung der Mikroarray-Technologie
wurde ein sogenanntes „Whole human Genome Expression Profiling“ von Ösophagus-
Plattenepithelkarzinomproben (n = 10) und gesundem Ösophagus Gewebe (n = 18)
durchgeführt. Die Ergebnisse der Microarrayanalyse wurden mittels
quantitativer real-time Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) in einer zweiten
und unabhängigen Kohorte (n = 71), bestehend aus Plattenepithelkarzinomen des
Ösophagus (n = 25), gesundem Ösophagus (n = 11), Adenokarzinomen des Ösophagus
(n = 13), Adenokarzinomen des Magens (n = 15) und des Kolons (n = 7)
validiert. Um die funktionelle Relevanz eines neu identifizierten Markergens
zu verstehen, wurde dessen Expression mittels siRNA-vermittelten Knockdown in
einer humanen Plattenepithelkarzinom-Zelllinie unterdrückt und die Wirkung
dieser Behandlung mit Hilfe einer weiteren Mikroarray-Analyse überprüft. Ein
Gen, das WD repeat Protein enthaltende Gen 66 (WDR66), erwies sich als
hochsignifikant überexprimiert in Plattenepithelkarzinomproben (P < 0,0001).
Eine hohe WDR66 Expression von solchen Karzinomen korrelierte signifikant mit
schlechtem Überleben (P = 0,031) der Patienten mit Ösophagus-
Plattenepithelkarzinomen. Multivariate Cox Regressionsanalyse zeigte, dass die
WDR66 Expression ein unabhängiger prognostischer Faktor (P = 0,042) blieb.
WDR66 Knockdown durch RNA-Interferenz hatte insbesondere Einfluss auf
Veränderungen der Expression von Membran-Komponenten. In
Plattenepithelkarzinomen des Ösophagus im Vergleich zu gesundem Epithel wurde
Vimentin stark exprimiert (P = 0,0008), während die Occludin Expression
reduziert war (P < 0,0001). Die Microarray-Daten wurden mittels qRT-PCR und
Western Blot Experimenten validiert. Der siRNA-vermittelte Knockdown von WDR66
führte außerdem zu einer Unterdrückung des Zellwachstums, zu reduzierter
Zellmotilität und einer verstärkten Apoptose der Zellen nach Zugabe von
Staurosporin und 5-Fluorouracil. Die Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass
WDR66 ein nützlicher Biomarker für die Risikostratifizierung von Patienten mit
Ösophagus-Plattenepithelkarzinomen ist. Als positiver Modulator der
Epithelial-mesenchymalen Transition (EMT) spielt WDR66 vermutlich eine
wichtige Rolle für Wachstum und Invasion von Ösophagus-
Plattenepithelkarzinomen. Dafür sprechen auch die Ergebnisse unserer
funktionellen Studien im in-vitro System. Darüber hinaus ist WDR66
möglicherweise ein neues Drug-Target für die Behandlung von
Plattenepithelkarzinomen des Ösophagus
