Inhalt Inhalt
........................................................................................................................V
I
Einleitung................................................................................................................9
1 Der Alkoholkonsum und seine Wirkung auf die Physiologie der Leber
...............................9 1.1 Die pathophysiologischen Auswirkungen des
Alkoholkonsums ................................... 9 1.2 Der Metabolismus und
die Metaboliten des Ethanols................................................
10 1.3 Die Leberzellproliferation im physiologischen und pathophysiologischen
Kontext ... 12 2 Die vielfältigen physiologischen Funktionen biogener
Monoamine.................................. 16 2.1 Biogene Monoamine als
Neurotransmitter und Gewebshormone ............................ 16 2.2 Das
serotonerge System
..............................................................................................
16 2.3 Die Dualität des serotonergen
Systems.......................................................................
17 2.4 Weitere biogene Monoamine
.....................................................................................
19 2.5 Die Signalvermittlung durch biogene Monoamine ‐ Rezeptoren und
Transporter .... 22 2.6 Die Familie der Transglutaminasen
.............................................................................
28 2.7 Die Funktionen der Transglutaminase
2...................................................................... 30 2.8
Die Monoaminylierung als posttranslationale
Modifikation....................................... 35 3 Die Glutaminreichen
und Polyglutaminabschnitt‐enthaltenden Proteine......................... 39
3.1 Physiologische und pathophysiologische Aspekte
...................................................... 39 3.2 Der
glutaminreiche Transkriptionsfaktor
CREB........................................................... 40 3.3 Der
glutaminreiche Transkriptionsfaktor SP1
............................................................. 43 3.4 Der
Polyglutaminabschnitt‐enthaltende Transkriptionsfaktor BRN2
......................... 46 3.5 Die Familie der Polyglutamin‐bindenden
Proteine ..................................................... 48 4
Zielsetzung......................................................................................................................
55 II Materialien und
Methoden..................................................................................57
1 Materialien
......................................................................................................................
57 1.1 Chemikalien und
Reagenzien.......................................................................................
57 1.2
Radiochemikalien.........................................................................................................
57 1.3 Puffer, Lösungen und Medien
.....................................................................................
57 1.4 Antikörper
....................................................................................................................
58 1.5
Oligonukleotide............................................................................................................
58 1.6
Plasmide.......................................................................................................................
59 2 Bakterienstämme und
Zelllinien.......................................................................................
59 2.1
Bakterienstämme.........................................................................................................
59 2.2
Zelllinien......................................................................................................................
60 3 Molekularbiologische Methoden
.....................................................................................
61 3.1 Isolierung und Analyse von Nukleinsäuren
................................................................. 61 3.2
Enzymatische und thermische Manipulation von
Nukleinsäuren............................... 63 3.3 Bakterienkulturen
........................................................................................................
69 4 Proteinbiochemische
Methoden.......................................................................................70
4.1 Isolierung und Analyse von Proteinen
.........................................................................70
4.2 TGM‐vermittelte Transamidierung und Analyse von
Proteinen..................................73 5
Zellkulturarbeiten.............................................................................................................76
5.1
Allgemein......................................................................................................................76
5.2 Kultivierung eukaryotischer
Zellen...............................................................................76
5.3 Langzeitlagerung eukaryotischer
Zellen.......................................................................77
5.4 Behandlungen eukaryotischer Zellen/ Herstellung von
Zelllysaten.............................77 5.5 Transfektion und Ernte
eukaryotischer Zellen
.............................................................78 5.6 Detektion
von Serotonin und Serotoninmetaboliten
..................................................78 5.7 Analyse der
eukaryotischen Zellproliferation
..............................................................79 5.8
Monoaminylierung der Proteine eukaryotischer Zellen
..............................................80 6 Tierphysiologische Studien
...............................................................................................81
6.1 Mausstämme und Haltungsbedingungen
....................................................................81 6.2
Untersuchung der freiwilligen Selbstverabreichung von Ethanol
...............................81 6.3 Schwanzbiopsien
..........................................................................................................82
6.4
Blutentnahme...............................................................................................................83
7 Statistische
Analyse..........................................................................................................83
III Ergebnisse
..........................................................................................................
85 1 Der Einfluss des serotonergen Systems auf Alkoholkonsum und
Leberregeneration ........85 1.1 Tph1‐/‐‐Tiere nehmen erhöhte Mengen an
Ethanol zu sich .........................................85 1.2 Eine
Präkonditionierung vermindert die erhöhte Präferenz der Tph1‐/‐‐Tiere zur
Ethanolaufnahme nicht
...............................................................................................86
1.3 Tph1+/+‐ und Tph1‐/‐‐Tiere verringern die Gesamtflüssigkeitsaufnahme in
der Konditionierungsphase
unterschiedlich......................................................................88
1.4 Tph1+/+‐Tiere weisen kaum veränderte Präferenzen für süßen, salzigen und
sauren Geschmack auf
............................................................................................................89
1.5 Die Gabe von 5‐Hydroxytryptophan verringert die erhöhte Ethanolaufnahme
der
Tph1‐/‐‐Tiere.................................................................................................................89
1.6 Die Gabe von 5‐Hydroxytryptophan reduziert das Körpergewicht von
Tph1‐/‐‐Tieren93 1.7 Die erhöhte Ethanolaufnahme ist nicht auf den genetischen
Hintergrund der Tph1‐/‐‐ Tiere
zurückzuführen...................................................................................................94
1.8 Kurzzeitiger Konsum von Ethanol führt bei Tph1‐/‐‐Tieren zu keinem
signifikant verstärkten
Leberschaden...........................................................................................97
1.9 Der Einfluss von Monoaminen auf die Proliferation von Leberzelllinien
....................99 2 Der molekulare Hintergrund der erhöhten
Ethanolaufnahme und der gestörten Leberregeneration der Tph1‐/‐‐Tiere
...............................................................................104
2.1 Die periphere Serotonindefizienz führt in der Leber zur Deregulation
unterschiedlichster Gene
..........................................................................................104
2.2 Ethanol beeinflusst den Katabolismus von Serotonin in β‐TC3‐Zellen
......................110 2.3 Die Behandlung mit Ethanol und Serotonin
verändert die Expression SP1‐abhängiger Gene in
HepG2..........................................................................................................
111 2.3 Die Monoaminylierung in verschiedenen Leberzelllinien
......................................... 113 3 Transkriptionsfaktoren als
Substrate für die Monoaminylierung.................................... 11����
3.1 BRN2, NonO und SFPQ sind Substrate von TGM2 in
vitro......................................... 116 3.2 BRN2, NonO und SFPQ
inkorporieren Histamin mittels TGM2 in vitro..................... 117 3.3 Die
Monoaminylierung von BRN2 vermindert die Bindung zum PORE‐Motiv.......... 118
3.4 Die Monoaminylierung von Polyglutaminabschnitt‐enthaltenden
Transkriptionsfaktoren verstärkt die Bindung zum Polyglutamin‐bindenden
Protein 1 ................ 120 3.5 Zelllinien unterschiedlicher Gewebe
exprimieren Mitglieder der Familie der Polyglutamin‐bindenden
Proteine............................................................................
121 4 Glutaminreiche Transkriptionsfaktoren als Substrate für die
Monoaminylierung .......... 122 4.1 Der Glutaminreiche Transkriptionsfaktor
CREB ist ein Substrat von TGM2 in vitro . 122 4.2 CREB wird in vitro
TGM2‐abhängig mit Serotonin und Histamin modifiziert ........... 123 4.3 Die
Monoaminylierung von CREB vermindert die Phosphorylierung durch PKA...... 124
4.3 Die Phosphorylierung von CREB durch PKA vermindert dessen Polymerisierung
durch TGM2.
.............................................................................................................
125 IV Diskussion
........................................................................................................
127 1 Das Fehlen von peripherem Serotonin aufgrund einer TPH1‐Defizienz führt
zu einem erhöhten
Alkoholkonsum...............................................................................................
127 1.1 Tph1‐/‐‐Tiere nehmen verstärkt Ethanol zu sich
........................................................ 127 1.2 Die
Supplementierung mit 5‐Hydroxytryptophan verringert die erhöhte
Ethanolaufnahme der Tph1‐/‐‐Tiere
.......................................................................... 131
1.3 Die Supplementierung mit 5‐Hydroxytryptophan reduziert das Körpergewicht
der Tph1‐/‐‐Tiere
..............................................................................................................
132 1.4 Die erhöhte Ethanolaufnahme der Tph1‐/‐‐Tiere ist nicht auf den
genetischen Hintergrund zurückzuführen
....................................................................................
133 1.5 Tph1‐/‐‐Tiere weisen Leberschäden auf, welche durch den kurzzeitigen
Ethanolkonsum nicht verstärkt werden
................................................................... 134 1.6
Der Einfluss verschiedener biogener Monoamine auf die Proliferation
unterschiedlicher Hepatocytenzelllinien
.................................................................. 136 2 Der
molekulare Hintergrund der erhöhten Ethanolaufnahme und der gestörten
Leberregeneration der Tph1‐/‐‐Tiere
...............................................................................
138 2.1 Die periphere Serotonindefizienz führt in der Leber zur Deregulation
verschiedener Gene des Ethanolmetabolismus und der
Leberregeneration........................ 138 2.2 Die Behandlung mit Ethanol
führt zu einer kompetitiven Hemmung von ALDH2 und damit zu einem verringerten
Abbau von 5‐Hydroxyindolacetaldehyd............. 146 2.3 Die Behandlung mit
Ethanol und Serotonin erhöht die Expression SP1‐ abhängiger
Gene.......................................................................................................
146 2.4 In Leberzellen werden Proteine
dopaminyliert......................................................... 148 3
Polyglutaminabschnitt‐enthaltende Transkriptionsfaktoren sind Substrate für
die TGMvermittelte Monoaminylierung
......................................................................................149
3.1 Polyglutaminabschnitte werden spezifisch und längenunabhängig
transamidiert...149 3.2 Die Monoaminylierung von BRN2 reguliert dessen
Bindungskapazität an DNA.......152 3.3 Polyglutamin‐bindende Proteine als
Regulatoren der Genexpression......................153 4 Der glutaminreiche
Transkriptionsfaktor CREB ist ein Substrat für die TGM‐vermittelte
Monoaminylierung
.........................................................................................................156
4.1 Glutaminreiche Abschnitte werden TGM‐abhängig transamidiert
...........................156 4.2 Die Monoaminylierung und Phosphorylierung
von CREB beeinflussen das Ausmaß der jeweils anderen
Modifikation....................................................................................157
5 Schlussfolgerung und therapeutischer
Ausblick..............................................................159 V
Literatur
............................................................................................................
167 VI
Anhang.............................................................................................................
195 A
Oligonukleotide..............................................................................................................195
B Expression ausgewählter Gene in der Leber von Tph1+/+‐ und Tph1‐/‐‐Mäusen
...............199 C Effizienzbestimmung der spezifischen Oligonukleotide für
die qPCR ..............................213 D Zusammenfassung
.........................................................................................................215
E
Abstract.........................................................................................................................216
F Danksagung
....................................................................................................................217
G
Lebenslauf.....................................................................................................................218
H
Publikationen.................................................................................................................219
I Selbständigkeitserklärung
...............................................................................................220
J
Abkürzungen...................................................................................................................221Studien an verschiedenen humanen ethnischen Gruppen bringen intronische
Polymorphismen der peripheren Form der Tryptophan‐Hydroxylase (TPH1) direkt
mit einem gesteigerten Risiko für die Entwicklung eines Alkoholismus und
außerdem mit einem frühen Eintrittsalter in die Alkoholabhängigkeit in
Zusammenhang. Zusätzlich gibt es humane und murine Genkopplungsstudien, die
eine erhöhte Ethanolpräferenz mit den Chromosomenabschnitten in Verbindung
bringen, auf denen jeweils TPH1 (11p15) und Tph1 (7qB4) liegen. Um diese
Beobachtung zu verifizieren und deren molekularen Hintergrund aufzuklären,
wurden Tph1‐/‐‐Mäusen ohne und nach vorheriger Konditionierung Ethanollösungen
unterschiedlicher Konzentrationen zur Wahl angeboten und die
Flüssigkeitsaufnahme mit der von Tph1+/+‐Mäusen mit ebenfalls homogen
gemischtem genetischen Hintergrund verglichen. Tph1‐/‐‐Tiere nahmen dabei von
Ethanollösungen aller Konzentrationen signifikant mehr auf. Die freiwillige
Ethanolaufnahme von Tph1+/‐‐Tieren mit homogen gemischten genetischen
Hintergrund nach Präkondtionierung lag ebenfalls signifikant über der von
Tph1+/+‐Tieren und verdeutlicht die Relevanz des Gendefekts als Ursache des
beobachteten Phänotyps. Die gesteigerte Ethanolaufnahme von Tph1‐/‐‐Tieren,
die über elf Generationen auf dem Inzuchtstamm C57BL/6J zur Hybridlinie
rückgekreuzt waren, konnte über die Wiederherstellung des peripheren
Serotonin‐Pools mittels Supplementierung mit 5‐Hydroxytryptophan (5‐HTP) auf
das Niveau der Tph1+/+‐Tiere abgesenkt werden. Mittels Überprüfung genetischer
Variationstypen über die Analyse veränderter
Restriktionsendonukleaseschnittstellen oder Sequenzierung von
Einzelnukleotidpolymorphismen konnte gezeigt werden, dass Tph1‐/‐‐Tiere der
elften Rückkreuzung bis 6 kb downstream und 308 kb upstream von Tph1 auf
Chromosom 7 den C57BL/6J‐ und dazwischen den 129/SvEvBrd‐Haplotyp aufweisen.
Eine Hochdurchsatz‐Sequenzierung des Lebertranskriptoms beider Genotypen mit
einem SOLiD4‐System zeigte eine Erhöhung der Aldh2‐Expression in
Tph1‐/‐‐Tieren, die aufgrund des verbesserten Ethanolabbaus den erhöhten
Konsum dieses Genotyps erklären könnte. Diese erhöhte Expression konnte
mittels qPCR verifiziert werden. Weiterhin zeigte sich eine Fehlregulation von
insgesamt 1111 Genen, unter denen zahlreiche Leberproliferations‐assoziierte
Gene zu finden waren. Dieser Befund bekräftigt eine Studie, die in
Tph1‐/‐‐Tieren eine gestörte Leberregeneration nachweist. Die Betrachtung
unterschiedlicher serologisch‐klinischer leberrelevanter Parameter beider
Genotypen im Anschluss an den präkonditionierten Ethanoltrinkanordnung ergab
keine Verstärkung der bereits vorhandenen Leberfunktionsstörung der
Tph1‐/‐‐Tiere. Auch die Behandlung verschiedener hepatischer Zelllinien mit
unterschiedlichen biogenen Monoaminen oder Ethanol ergab keinen eindeutigen
Einfluss auf die Proliferationsrate, die anhand der mitochondrialen Aktivität
und der DNA‐Menge quantifiziert wurde. Um zu untersuchen, ob die
differentielle Genexpression in der Leber der Tph1+/+‐ und Tph1‐/‐‐Mäuse auf
eine Serotonylierung von Transkriptionsfaktoren (TF) zurückzuführen sei,
welche analog zu der Modifikation von GTPasen eine physiologsiche Funktion
ausüben könnte, wurden verschiedene TF in vitro exemplarisch monoaminyliert
und mittels EMSA‐ und Affinitätsexperimenten untersucht. Es zeigte sich neben
der Modifikation aller untersuchter TF, dass eine Monoaminylierung
inhibitorisch z.B. auf die Bindung von BRN2 an seine Zielsequenz wirkt und die
Interaktion von drei TF zu dem Polyglutamin‐bindenden Protein 1, das als
Suppressor der Aktivität des TF BRN2 bekannt ist, durch die Modifikation
unabhängig von der Länge des Polyglutaminabschnitts verstärkt wird. Unabhängig
vom zugrunde liegenden molekularen Mechanismus für den erhöhten freiwilligen
Ethanolkonsum und die Leberfunktionsstörung der Tph1‐/‐‐Mäuse, scheint die
Verabreichung von 5‐HTP ein lohnenswerter, untersuchungswürdiger, neuer
Therapieansatz bei der Suchttherapie und einer verbesserten Leberregeneration
von Alkoholikern mit Polymorphismen in TPH1 zu sein.Intronic polymorphisms of the peripheral isoform of tryptophan hydroxylase
(TPH1) are associated with the development of alcoholism and even with the age
of onset of alcoholism related behaviour in different human ethnic groups.
Furthermore, genetic linkage studies in human and mice have shown a relation
of an increased voluntary ethanol intake to the chromosomal section harbouring
TPH1 (11p15) and accordingly Tph1 (7qB4). To clarify the role of TPH1 in the
context of voluntary ethanol intake behaviour and the molecular background of
this association Tph1+/+ and Tph1‐/‐ mice with homogenic genetic background
were subjected to a two‐bottle choice paradigm avoidance test with and without
prior conditioning to ethanol. Using increasing concentrations of alcoholic
solutions Tph1‐/‐ mice had a higher intake of all applied concentrations
compared to the wildtype. With prior conditioning Tph1+/‐ mice with homogenic
genetic background had a significant higher intake of ethanol as well,
emphasizing the gene defect as the reason for the seen phenotype. Through
administration of the serotonin precursor 5‐hydroxytryptophan (5‐HTP) Tph1‐/‐
mice (backcrossed to C57BL/6J, 11th generation) exhibit a voluntary ethanol
intake comparable to the Tph1+/+ (C57BL/6J) mice intake. The genetic
background of the backcrossed Tph1‐/‐ mice on chromosome 7 was analyzed by
utilizing altered restriction endonuclease sites and sequencing analysis of
single nucleotide polymorphisms. The mice showed the genotype of the strain
129/SvEvBrd in between 6 kb downstream and 308 kb upstream of Tph1 and the
C57BL/6J genotype outside of this section. The high‐throughput sequencing of
the liver transcriptome of both genotypes using the SOLiD4 technology
exhibited an increase in the gene expression of Aldh2 in the Tph1‐/‐ mice. The
enhanced gene expression could be verified using qPCR and might be the main
reason for the increased voluntary ethanol intake. Additionally, the liver of
the Tph1‐/‐ mice displayed an altered gene expression of 1111 genes
altogether, of which several genes are associated to hepatocyte proliferation.
This finding confirms a former study showing a disturbed liver regeneration in
Tph1‐/‐ mice. The serological‐clinical liver‐related parameters were taken
subsequent to the preconditioned avoidance test, but offered no enhancement of
the existing disturbance of liver function in Tph1‐/‐ mice. Moreover, hepatic
cell lines were treated with different biogenic monoamines and ethanol and the
proliferation rate quantified on the basis of mitochondrial activity and the
amount of DNA. None of the treatments revealed an explicit influence on
hepatocyte proliferation. Knowing that the serotonylation of small GTPases ha
