The hormone Endothelin‐1 (ET‐1) exerts vasoconstrictive, inotropic, fibrotic
and mitogenic effects on the cardiovascular system through the activation of
ET receptor A. On the other hand, activation of ET receptor B stimulates the
endothelial nitric oxide synthase (eNOS); NO presents strong vasodilative and
cardioprotective properties and represses ET‐1 expression. The clinical
relevance of this delicate interplay has been acknowledged because of its
implication in many cardiovascular diseases, such as pulmonary arterial
hypertension, systemic hypertension, and coronary artery disease. However, the
underlying molecular mechanisms remain to be fully clarified. ET‐1 transgenic
(ET+/+) mice develop pulmonary, cardiac and renal fibrosis, glomerulosclerosis
and decreased glomerular filtration rate. However, in spite of the strong
vasoconstrictive feature of ET‐1, ET+/+ mice remain normotensive. The natural
functional antagonist of ET‐1, NO, was assumed to counteract the ET‐1 effect
on blood pressure in ET+/+ mice. To test this hypothesis in vivo, ET+/+ mice
were crossbred with eNOS knock‐out (eNOS‐/‐) mice. Similar to the eNOS‐/‐
model, the ET+/+eNOS‐/‐ mice develop high blood pressure compared to wild type
(WT) and ET+/+ animals. However, at the age of nine months, the eNOS‐/‐, but
not ET+/+eNOS‐/‐ mice, are characterized by diastolic dysfunction. These
findings suggested that transgenic overexpression of ET‐1 on an eNOS‐/‐
background could be beneficial for diastolic functions. In this thesis, it is
shown that cardiac ET‐1 gene expression was elevated in both eNOS‐/‐ and
ET+/+eNOS‐/‐ mice compared to WT at the age of nine months with no significant
difference between these groups. This suggests that the functional differences
observed between eNOS‐/‐ and eNOS‐/‐ET+/+ animals are due to the chronic
overexpression of ET‐1 mediated by the transgene, which may have conditioned
ET+/+eNOS‐/‐ animals over time to prevent the development of diastolic
dysfunction. In line with this, eNOS‐/‐ animals displayed normal cardiomyocyte
diameters at the age of three months, but developed cardiac hypertrophy at the
age of nine months, whereas ET+/+eNOS‐/‐ mice showed enlarged cardiomyocytes
at the age of three months that were not detectable in animals nine months of
age. Histological analysis showed that cardiac arterioles were dilated in both
ET+/+ and ET+/+eNOS‐/‐ mice compared to WT and eNOS‐/‐ mice. By enhancing
blood flow, this could be beneficial for cardiac functions. In order to
dissect the molecular changes underlying this phenomenon, the cardiac proteome
of the different genotypes were compared to WT using two‐dimensional
electrophoresis coupled to mass spectrometry. Because these changes may take
place early in the life of the animals, three months old animals were
analyzed. The proteomics study revealed that transgenic overexpression of
ET‐1, with or without eNOS, led to a higher abundance of proteins regulating
oxidative stress indicating that, in contrast to eNOS‐/‐ animals, ET+/+ and
ET+/+eNOS‐/‐ mice developed molecular mechanisms limiting oxidative damages.
Moreover, diastolic dysfunction observed in eNOS‐/‐ mice may be explained by
the differential abundance of proteins involved in the contractile machinery.
Overexpression of ET‐1 in eNOS‐/‐ mice restored these changes and may have
thereby benefited the cardiac functions. Finally, this study indicated that a
shift from fatty acid to glucose metabolism, considered as cardioprotective,
may have occurred to a greater extent in crossbred animals than in eNOS‐/‐
mice. Taken together, this study showed that transgenic overexpression of ET‐1
in mice can have beneficial effects on cardiac function, even in the absence
of eNOS, by modulating various systems (oxidative stress, contractile
machinery, and energy metabolism). The clinical relevance of these findings
should be confirmed by analyzing the impact of a pharmacological interference
with these systems on cardiac function. Finally, the fact that additional
overexpression of ET‐1 restored the deleterious effect of eNOS deficiency
underlines the importance of the interplay between the two systems in the
heart of mice.Endothelin‐1 (ET‐1) ist ein Peptidhormon, das durch Aktivierung des ET‐1
Rezeptors A vasokonstriktorische, inotrope, fibrotische und mitogene Effekte
im kardiovaskulären System vermittelt. Gleichzeitig stimuliert Aktivierung des
ET‐1 Rezeptors B die endotheliale Stickstoffmonoxid‐Synthase (eNOS), wobei NO
starke vasodilatative and kardioprotektive Eigenschaften aufweist und die ET‐1
Expression hemmt. Aufgrund seines wesentlichen Einflusses auf zahlreiche
Erkrankungen des kardiovaskulären Systems wie zum Beispiel die
pulmonal‐arterielle und systemische Hypertonie oder die koronare
Herzerkrankung ist dieses fein abgestimmte Gleichgewicht von erheblicher
klinischer Relevanz; die zugrundeliegenden molekularen Mechanismen konnten
bislang jedoch nur unvollständig identifiziert werden. In vorangegangenen
Arbeiten konnte gezeigt werden, dass transgene Mäuse mit einer ET‐1
Überexpression eine pulmonale, kardiale und renale Fibrose sowie eine
Glomerulosklerose mit verminderter glomerulärer Filtrationsrate entwickeln.
Interessanterweise zeigen diese Tiere jedoch trotz der bekannten
vasokonstriktorischen Effekte von ET‐1 keine Hypertonie. Um die Hypothese,
dass dies auf eine Antagonisierung der ET‐1 Wirkung durch NO zurückzuführen
ist, in einem in vivo System zu überprüfen, wurden ET+/+ Mäuse mit eNOS
knock‐out Tieren (eNOS‐/‐) gekreuzt. Analog zum Phänotyp der eNOS‐/‐ Tiere
zeigte sich in diesem kombinierten ET+/+eNOS‐/‐ Modell eine arterielle
Hypertonie. Während eNOS‐/‐ Mäuse jedoch im Alter von neun Monaten eine
diastolische Dysfunktion entwickelten, waren diese Veränderungen im
kombinierten ET+/+eNOS‐/‐ Modell nicht nachzuweisen, so dass sich damit
Hinweise für einen möglichen protektiven Effekt der ET‐1 Überexpression auf
die diastolische Funktion ergaben. In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt,
dass sowohl eNOS‐/‐ als auch ET+/+eNOS‐/‐ Tiere im Alter von neun Monaten eine
im Vergleich zu Wildtypkontrollen erhöhte ET‐1 Expression zeigen, die sich
zwischen diesen Gruppen nicht signifikant unterscheidet. Dies deutet darauf
hin, dass die funktionellen Unterschiede zwischen beiden Modellen darauf
zurückzuführen sein könnten, dass die Expression des ET‐1 Transgens in
ET+/+eNOS‐/‐ Tieren zu einer bereits früh beginnenden ET‐1 Überexpression
führt, während sich dies in eNOS‐/‐ Mäusen erst im Verlauf entwickelt. Eine
chronische ET‐1 Überexpression könnte so im kombinierten ET+/+eNOS‐/‐ Modell
zu einer Konditionierung der Tiere führen, die im weiteren Verlauf die
Entwicklung einer diastolischen Dysfunktion verhindert. Dies wird durch die
Beobachtung unterstützt, dass eNOS-/‐ Tiere im Alter von drei Monaten normale
Kardiomyozytendurchmesser aufweisen, im Alter von neun Monaten jedoch eine
kardiale Hypertrophie entwickeln, während eine im Alter von drei Monaten in
ET+/+eNOS‐/‐ Mäusen nachweisbare Vergrößerung der Kardiomyozytendurchmesser in
neun Monate alten Tieren nicht mehr nachweisbar ist. Histologisch zeigte sich
darüber hinaus im Vergleich zu Wildtyp‐Kontrollen und eNOS‐/‐ Tieren sowohl in
ET+/+ als auch in ET+/+eNOS‐/‐ Mäusen eine Dilatation kardialer Arteriolen, so
dass eine vermehrte myokardiale Durchblutung zu den beobachteten funktionellen
Unterschiede beitragen könnte. Um die molekularen Mechanismen, die diesen
Beobachtungen zugrunde liegen, zu analysieren, erfolgte ein Vergleich des
kardialen Proteoms jeder Genotypen mit Wildtyp Kontrollen durch
zweidimensionale Elektrophorese in Kombination mit Massenspektrometrie. Hier
zeigte sich, dass die Überexpression von ET‐1 sowohl im Wildtyp als auch im
eNOS ‐/‐ Hintergrund zu einer höheren Expression von Proteinen der oxidativen
Stressantwort führt. Dies deutet darauf hin, dass ET+/+ and ET+/+eNOS‐/‐ Tiere
im Gegensatz zu eNOS‐/‐ Mäusen molekulare Mechanismen entwickelt haben, um
Schäden durch oxidativen Stress zu limitieren. Darüberhinaus war die
beobachtete diastolische Dysfunktion in eNOS‐/‐ Mäusen mit Änderungen in der
Expression von Proteinen, die bei der Regulation kontraktiler Prozesse eine
Rolle spielen, assoziiert. ET‐1 Überexpression führte in eNOS‐/‐ Tieren zu
einer Antagonisierung dieser Veränderungen. Schließlich zeigte sich in diesen
Untersuchungen, dass im ET+/+eNOS‐/‐ Modell im Gegensatz zu eNOS‐/‐ Tieren in
höherem Maße eine Verschiebung vom Fettsäure‐Metabolismus zur vermehrten
Glukose‐Utilisation erfolgt, die als kardioprotektiv betrachtet wird.
Zusammenfassend wird in der vorliegenden Arbeit damit gezeigt, dass eine
chronische Überexpression von ET‐1 in Mäusen durch die Modulation
verschiedener Systeme (oxidativer Stress, Kontraktionsprozesse,
Energiemetabolismus) auch in Abwesenheit der eNOS protektive Effekte auf die
kardiale Funktion haben kann. Untersuchungen zum Einfluss einer
pharmakologischen Modulation dieser Systeme auf kardiale Funktionsparameter
könnten dazu beitragen, die klinische Relevanz dieser Beobachtungen zu
überprüfen
