Titelblatt
Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis
1\. Einleitung
1.1. Modell Organismen
1.1.1. Der Zebrafisch
1.1.2. Der Medakafisch
1.1.3. Der Fugufisch
1.1.4. Lanzettfisch
1.2. Isolierung und Analyse von Genen
1.2.1. Mutagenese-Screen
1.2.2. Genetisches Kartieren
1.2.3. Physikalisches Kartieren
1.2.4. Sequenzanalyse
2\. Material und Methoden
2.1. Materialien und Chemikalien
2.1.1. Chemikalien
2.1.2. Enzyme
2.1.3. Molekulargewichtsstandards
2.1.4. Oligonukleotide
2.1.5. Klonierungsvektoren
2.1.6. E. coli-Stämme, Zellinien und Fische
2.2. Häufig verwendete Lösungen
2.3. Medien und Zellkultur
2.3.1. Bakterienmedien und Zellkultur
2.3.2. Zebrafisch Zellkultur
2.4. Experimentelle Methoden
2.4.1. Nukleinsäure-Extraktionsprotokolle
2.4.2. DNA Manipulationen
2.4.3. Subtraktive Klonierung
2.4.4. Klonierungsverfahren
2.4.5. Elektrophorese
2.4.6. Hybridisierungstechniken
2.4.7. PCR Techniken
2.4.8. Haploide Zebrafisch Embryos
2.5. Daten-Analyse
2.5.1. Sequenz-Analyse
2.5.2. Kopplungs-Analyse
3. Ergebnisse
3.1. Genetisches Kartieren im Zebrafisch
3.1.1. Identifikation polymorpher Zebrafischstämme
3.1.2. Testen der verschiedenen repetitiven Elemente auf ihre Tauglichkeit für
IRS-PCR
3.1.3. Verteilung der ´mermaid´ Elemente im Zebrafisch-Genom
3.1.4. Abschätzung der Häufigkeit der ´mermaid´-Elemente im Genom
3.1.5. Konstruktion der ´inter-mermaid´-Marker-Banken
3.1.6. Charkterisierung der ´inter-mermaid´-Marker-Banken
3.1.7. Identifikation polymorpher Klone in den Marker-Banken
3.1.8. Hybridisierung der polymorphen Klone auf Kartierungsfilter
3.1.9. Integration von genetischer, cytogenetischer und physikalischer Karte
3.1.10. Testen der Repräsentativen Differenz Analyse (RDA) als alternative
Strategie
3.2. Genetisches Kartieren im Medakafisch
3.2.1. IRS-PCR-Strategie
3.2.2. Analyse mittels AFLP-Hybridisierung
3.3. Analyse eines Amphioxus Cosmids
3.3.1. Cosmidbank
3.3.2. Sequenzanlyse
3.3.3. Gen-Inhalt des Amphioxuscosmids MPMGc117B0533
3.3.4. Repetitive Elemente innerhalb des Amphioxuscosmids MPMGc117B0533
4\. Diskussion
4.1. Wahl der Organismen
4.2. Genetische Kartierung im Zebrafisch
4.2.1. Wahl der ´Stämme´ für das Kartierungs-Panel
4.2.2. IRS-PCR-Strategie
4.2.3. Identifikation polymorpher Klone in den Markerbanken
4.2.4. Kopplungsanalyse
4.2.5. Integration von genetischer und physikalischer Karte
4.2.6. Alternative Hybridisierungsstrategie - RDA
4.2.7. Abschließende Bewertung und Ausblick
4.3. Genetische Kartierung im Medaka
4.3.1. IRS-PCR im Medaka
4.3.2. Anwendung einer modifizierten AFLP-Strategie im Medaka
4.3.3. Abschließende Beurteilung und Ausblick
4.4. Analyse eines Amphioxus Cosmids
4.4.1. Bedeutung des Amphioxusgenoms für die Analyse des Vertebratengenoms
4.4.2. Basenzusammensetzung des Cosmids
4.4.3. Gengehalt des Amphioxuscosmids
4.4.4. Repetitive Elemente innerhalb des Amphioxuscosmids MPMGc117B0533
4.4.5. Kombination von EST-Projekt und genomischer Sequenzanalyse
5a Zusammenfassung
5b Summary
6\. Danksagung
7\. Literaturverzeichnis
8\. Anhang
8.1 Sequenzvergleich von mermaid-Elementen aus dem Zebrafisch
8.2. Sequenzvergleich repetitiver Elemente des Medaka-Fisches
8.3. Verteilungsschlüssel für die Kartierungsfilter
8.4. Sequenzdaten einiger ´inter-mermaid´-Marker
8.5. Publikationsliste
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125Innerhalb dieser Doktorarbeit wurden verschiedene Aspekte der Analyse
komplexer Genome untersucht. Zunächst wurde die Anwendbarkeit verschiedener,
auf Hybridisierung beruhender Techniken für das genetische Kartieren in den
Genomen von Zebra- und Medakafisch getestet. Diese sollten ein effizientes
Kartieren mit einer hohen genetischen Auflösung erlauben. Die einfachste
Möglichkeit Marker zu generieren, die durch Hybridisierung kartiert werden
können, ist die IRS-PCR. Diese PCR-Technik nutzt die im Genom eingestreuten
repetitiven Elemente aus, um die nicht repetitive Frakton des Genoms zu
amplifizieren, die zwischen zwei dieser Elemente liegt. Dieses komplexe PCR-
Produkt wurde kloniert und etwa 1000 individuelle Klone einer rund 16.000
Klone umfassenden Marker-Bibliothek wurden auf kleine ´Southern´-blots
hybridisiert, die IRS-PCR-Produkte verschiedener Zebrafischstämme enthielten.
Die Klone, die auf den Southernblots einen +/- -Polymorphismus zeigten, wurden
anschließend auf "Kartierungsfilter" hybridisiert, die IRS-PCR-Produkte von
vier verschiedenen Kreuzungen enthielten. Bei dieser Vorgehensweise traten
zwei Schwierigkeiten auf: Zum einen wurden aufgrund einer gewissen Redundanz
der Marker-Bank wiederholt die gleichen Klone analysiert. Dieses Problem
konnte teilweise gelöst werden, indem die gesamten Marker-Bank durch ´Oligo-
fingerprinting´ analysiert wurde, und Klone mit ähnlichen ´fingerprints´ in
Clustern zusammengefaßt, und dann repräsentative Klone verschiedener Cluster
untersucht wurden. Das größere Problem war jedoch der hohe Grad an
Variabilität innerhalb der Zebrafisch-Stämme, so daß schließlich nur 30% der
Marker, die zuvor als polymorph identifiziert wurden, auf der Karte plaziert
werden konnten. Insgesamt konnten aber dennoch rund 80 verschiedene Marker auf
einer der Referenz-Kreuzungen ausgewertet werden, und 50 davon zeigten
genetische Kopplung zu wenigstens einem weiteren Marker. Im Medakafisch wurde
diese Strategie ebenfalls, jedoch mit einer Kombination von Primern, die für
drei verschiedene repetitive Elemente komplementär sind, getestet. Aus der
3800 Klone umfassenden Marker-Bank wurden hundert potentielle Marker auf
Southern blots getestet. Die Rate an polymorphen Markern lag mit 30 % mehr als
doppelt so hoch wie im Zebrafisch. Darüber hinaus waren 50 % der als polymorph
identifizierten Marker auch auf einer F2-Kreuzung zweier verschiedener
Populationen polymorph. Dies zeigt, daß im Medakafisch die Stämme genetisch
gut getrennt und innerhalb eines Stammes relativ homozygot sind. Um weitere
genetische Marker zu finden, die außerdem eine gleichzeitige Verknüpfung von
genetischen Kartierungsdaten und genomischen Klonen erlaubten, wurde für den
Medakafisch eine modifizierte AFLP-Methode entwickelt. Nach Hybridisierung von
Amplikons, die aus zwei verschiedenen Medakafischstämmen generiert wurden, auf
eine Cosmid-Bank, wurden 80 Klone isoliert, die ein differentielles
Hybridisierungsmuster aufwiesen. Aus 20 % der so identifizierten Cosmide ließ
sich eine Probe isolieren, die sich auf einer F2-Geschwister-Kreuzung
kartieren ließ. Ein weiterer Aspekt bei der Untersuchung komplexer Genome ist
die vergleichende Sequenzanalyse. Dadurch können Einblicke in Genomevolution
und -organisation gewonnen werden. Innerhalb dieser Arbeit wurde ein 40 kb
großer Klon aus einer Amphioxus-Cosmid-Bank sequenziert, mit verschiedenen
Exon-Vorhersage-Programmen (Grail, GenScan, Mzef) untersucht und mit zwei
öffentlichen (Genbank, Swissprot) und einer internen (Amphioxus-EST)
Sequenzdatenbanken verglichen. Dabei konnte unter anderem ein Gen der Aldo-
Keto-Reduktase-Familie identifiziert werden. Es konnte ferner gezeigt werden,
daß sich genomische Sequenzanalyse und EST-Projekte komplementieren.During the work for this thesis several aspects of the analysis of complex
genomes were explored. Firstly, the applicability of different hybridisation
based approaches for genetic mapping was tested in the genomes of zebrafish
and medakafish. Such approaches should allow efficient mapping of new markers
to a high resolution. IRS-PCR is the simplest possibility to generate markers
that can be mapped by hybridisation. It takes advantage of interspersed
repetitive sequences in the genome to amplify a set of unique DNAs between two
of such elements. The PCR-products were cloned and more than 1000 individual
clones of a 16 thousand clone containing marker library were tested for
polymorphism on small southern blots of complex IRS-PCR product of different
Zebrafisch strains. The markers identified polymorphic were subsequently
hybridised on mapping filters onto which IRS-PCR-products of individuals of
four different mapping crosses were spotted. Two major difficulties were found
with this approach: Because of the redundancy of the library clones were
tested repeatedly. This problem could be overcome by analysing the whole
marker library by oligo-fingerprinting and grouping the clones with similar
fingerprints in clusters. Representatives of different clusters were then used
as hybridisation probes and sequenced. The major problem, however, was the
high degree of variability within the zebrafish strains. Because of this less
than 10 % of the markers that were identified polymorphic on Southern blots
were informative on a reference cross and could be placed on a map. Despite of
the encountered problems around 80 markers could be scored on one of the
reference crosses, and 50 of those showed linkage to at least one further
clone. The size of the genetic map of the Zebrafish estimated from these
experiments is around 2700 cM and thus very close to the size determined from
other laboratories (2635 cM). The same strategy was also tested for the
Medakafish, however with a combination of primers, specific for three
different repetitive elements. From the 3800 clone medaka library hundred
clones were tested on Southern blots. The rate of polymorphic markers was
almost 30% and compared to the zebra fish more than twice as high. Moreover 15
% of the makers previously identified polymorphic were informative on an
F2-intercross of different strains. This indicates a much higher genetic
distance between the different strains than in the Zebrafish. In order to
generate further markers that could simultaneously be linked to genomic clones
a modified AFLP-technique was developed. After differential hybridisation of
two amplicons generated from different strains on a cosmid library 80 clones
with a differential hybridisation pattern could be identified. It was possible
to isolate a probe from 20 % of the cosmids, and more than 50% could be mapped
on a F2-intercross. A further aspect of the analysis of complex genomes is the
comparative sequence analysis. By comparison of genomic sequences of different
species it is possible to get insights into gemone evolution and
-organisation. Within this work a 40 kb clone of an amphioxus cosmid-library
was sequenced, analysed with different exon prediction programs and the
deduced protein sequence was compared with two public and one in house
sequence database. This has led to the identification of a gene of the aldo-
keto reductase family as well as further exons which gave a significant
database match to known genes. Furthermore it could be demonstrated that
genomic sequence analysis and EST projects complement each other well
