Die Rolle des Differenzierungsgrades von somatischen Zellen bei dem Reprogramming in induzierte pluripotente Stammzellen

Abstract

Introduction 1.1 Mammalian development 1.2 Classification of cells and their developmental potential 1.3 Pluripotent stem cells 1.3.1 ES cells and pluripotency 1.3.2 Pluripotency factors 1.3.3 Other types of pluripotent cells - EC, EG, ES-like and EpiS cell 1.4 Epigenetic regulation in pluripotent cells 1.5 Different strategies to reprogram somatic cells 1.5.1 Reprogramming by nuclear transfer 1.5.2 Reprogramming by cell fusion 1.5.3 Culture-induced reprogramming 1.5.4 “Trans-differentiation” / ”Lineage-conversion” 1.5.5 Direct reprogramming by defined transcription factors into induced pluripotent stem (iPS) cells 1.5.6 Potential clinical and pharmaceutical applications of iPS cells 1.5.7 Development of a “secondary” iPS system 2\. Aims of this thesis 3\. List of publications 3.1 Publication 1: Stem Cells manuscript Eminli et al. 2008 3.2 Publication 2: Nature Genetics manuscript Eminli et al. 2009 3.3 Additional data for Nature Genetics manuscript Eminli et al. 2009 4\. Erklärung über Eigenanteil an den Publikationen 5\. Discussion 5.1 Somatic cells from all three germ layers can be reprogrammed into iPS cells (Aim 1.1 published in Eminli et al. 2008) 5.2 Sox2 is dispensable for the reprogramming of NPCs into iPS cells (Aim 1.2 published in Eminli et al. 2008) 5.3 Differentiation state determines reprogramming potential of hematopoietic cells into iPS cells (Aim 2 published in Eminli et al. 2009) 5.4 Perspectives 6\. Summary 7\. Zusammenfassung 8\. Bibliography 9\. Abbreviation list 10\. Publication record 11\. Acknowledgements-Danksagung 12\. Eidesstattliche ErklärungDirect reprogramming of somatic cells into induced pluripotent stem (iPS) cells has been achieved by overexpression of defined transcription factor combinations such as c-Myc, Klf4, Oct4 and Sox2. iPS cells are molecularly highly similar to embryonic stem (ES) cells and can differentiate into virtually any cell type of the body including germ cells. This observation makes iPS cells very attractive for basic research and potential clinical applications. This PhD thesis consists of two parts; the first part was aimed at studying the role of the somatic cell-of-origin in factor-mediated reprogramming while the second part is aimed at determining whether the differentiation stage of the starting cell affects the efficiency of reprogramming. In the first part, I showed that a defined ectodermal cell type, specifically Neural Progenitor Cells (NPCs), can be reprogrammed into iPS cells, thus demonstrating that cells from all three germ layers are equally amenable to reprogramming into iPS cells by the four factors. Another main conclusion of this part is the observation that cells, which already express one of the four reprogramming factors endogenously, can be reprogrammed with fewer exogenous factors. In particular, NPCs, which express high levels of Sox2, could be reprogrammed into iPS cells in the absence of exogenous Sox2. The second part of this thesis provided the first direct link between the differentiation stage of cells and their reprogramming potential into iPS cells. By using nine different immature hematopoietic cell populations and their differentiated progenies, I showed that immature cells are more amenable to reprogramming than differentiated cell types. For example, adult hematopoietic stem and progenitor cells converted 300 times more efficiently and twice as fast as terminally differentiated cells into iPS cells. Moreover, I was able to translate these observations into a human setting by generating the first human umbilical cord blood-derived iPS cells. In summary, this thesis provides novel biological insights into the role of the somatic cell-of-origin in direct reprogramming and may ultimately facilitate a more efficient and safer generation of patient specific iPS cells.Somatische Zellen können durch die Überexpression von vier verschiedenen Transkriptionsfaktoren, c-Myc, Klf4, Oct4 and Sox2, in sogenannte induzierte pluripotente Stammzellen (iPS Zellen) reprogrammiert werden. Es scheint, dass iPS Zellen und embryonale Stammzellen (ES Zellen) sich in ihren Eigenschaften sehr ähnlich sind. ES Zellen wie auch iPS Zellen haben das Potential, sich in jeden Zelltyp des Körpers zu entwickeln. Diese Eigenschaft macht iPS Zellen zu einem attraktiven Target für die Grundlagenforschung, öffnet aber auch weitreichende Möglichkeiten für potentielle therapeutische Anwendungenszwecke. Diese Doktorarbeit besteht aus zwei Teilen; der erste Teil befasste sich mit der Rolle des Ausgangzelltyps in Bezug auf Faktoren- vermittelte Reprogrammierung während der zweite Teil untersucht, ob der Differenzierungsgrad einen Einfluss auf die Effizienz von somatischer Zellreprogrammierung hat. Im ersten Teil dieser Doktorarbeit konnte gezeigt werden, dass ein bestimmter ektodermaler Zelltyp, insbesondere neurale Vorläuferzellen, in iPS Zellen reprogrammiert werden können, und bestätigte damit, dass Zellabkömmlinge von allen drei Keimblättern gleichermaßen zugänglich sind, um mit den selben 4 Faktoren in iPS Zellen reprogrammiert zu werden. Ein weiteres wichtiges Ergebnis des ersten Projekts ist, dass Zellen, die bereits einen der 4 Reprogrammierungsfaktoren endogen exprimieren, weniger exogene Faktoren benötigen, um iPS Zellen zu produzieren. Es konnte gezeigt werden, dass neurale Vorläuferzellen, die vergleichbare Mengen an Sox2 exprimieren wie ES Zellen, auch ohne virale Überexpression von Sox2 in iPS Zellen reprogrammiert werden können. Im zweiten Teil dieser Doktorarbeit konnte erstmals ein Zusammenhang zwischen dem Differenzierungsgrad somatischer Zellen und deren Reprogrammierungspotential in iPS Zellen aufgezeigt werden. Zu diesem Zweck wurden 9 verschiedene hämatopoetische unreife Zellpopulationen und ihre differenzierten Abkömmlinge isoliert. Weiter konnte gezeigt werden, dass unreifen Zelltypen ein generell viel höheres Reprogrammierungspotential besitzen als differenzierte Zellen. Beispielsweise konnten hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen 300-fach effizienter und zweimal schneller in iPS Zellen umgewandelt werden verglichen mit differenzierten Zelltypen. Darüber hinaus konnten wir unsere Beobachtungen auch auf humane Zellen übertragen, indem wir zum ersten Mal aufzeigten, dass menschliches Nabelschnurblut in iPS Zellen umgewandelt werden kann. Zusammenfassend lieferte diese Doktorarbeit neuartige biologische Erkenntnisse über die Rolle der somatischen Ausgangsszelle im Zusammenhang mit Faktoren-vermittelter Reprogrammierung und mag damit letztendlich die effiziente und sicherere Erzeugung von Patienten- spezifischen iPS Zellen ermöglichen