Multiple Sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disorder of the central
nervous system (CNS), characterized by lymphocyte infiltration and
inflammation of the CNS leading to dymelination and axonal/neuronal damage.
Despite the development of promising treatment strategies in the murine model
experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), the detailed therapeutic
target mechanisms and the disease underlying cellular and molecular pathways
directly in the CNS still remain uncertain, since specific issues regarding
immune cell dynamics and the complex neuro-immune crosstalk can not be
addressed by conventional experimental approaches. To overcome these
limitations I applied time lapse two-photon laser scanning microscopy (TPLSM)
to investigate the cellular migration of various T cell subsets in living
brain tissue. First, T cells, isolated from atorvastatin treated mice or after
pharmacological activation of the bradykinin receptor B1 revealed a reduced
migratory capacity as compared to vehicle treatment. Secondly, cellular
dynamics of differentiated effector CD4 T cells are characterized by a
predominant vessel alignment in contrast to CD8 T cells, which randomly
infiltrate the whole CNS parenchyma. This CD4 T cell compartmentalization was
mediated by CXCR4 functioning, whereas the adhesion molecules LFA-1 and the
chemokine receptor CCR7 are not involved in this homing process. Obviously,
TPLSM allows to visualize cellular dynamics deep in intact tissues and thereby
contributes to the clarification of therapeutic but also general pathologic
target pathways. However some pitfalls still remain due to limited excitation
wavelengths between 780-1050 nm. The evaluation of long wavelength infrared
(IR) excitation by an optical parametric oscillator (OPO) versus near infrared
(NIR) excitation by a Titanium:Sapphire (Ti:Sa) laser revealed enhanced
penetration depths, an increased depth-dependent spatial resolution and a
reduced photobleaching for OPO-excited tdRFP (tddimer2(12) red fluorescent
protein) as compared to Ti:Sa-excited EGFP (Enhanced Green Fluorescent
Protein) in brain slices, explanted lymph nodes and in the brain of living
anesthetized mice. As far as the development of new experimental approaches is
concerned, it is further demonstrated that two red fluorescent proteins, i.e.
tdRFP and mCherry, can be simultaneously excited and spectrally separated by
the OPO-based TPLSM setup. Moreover, using dual Ti:Sa- and OPO-based TPLSM
both, cellular dynamics and functional responses, can be visualized during
CNS-inflammation. In summary, additionally to the demonstrated advantages
regarding image quality new possibilities emerge to elucidate detailed
pathomechanisms in the target organ of neuroinflammation by the use of
extended excitation wavelengths for TPLSM.Multiple Sklerose (MS) ist eine chronisch entzündliche Erkrankung des
Zentralen Nervensystems (ZNS), deren charakteristische Merkmale Demyelinierung
und axonaler/neuronaler Schaden durch Lymphozyteninfiltration und Entzündung
des ZNS initiiert werden. Trotz der Entwicklung vielversprechender
Therapieoptionen im murinen Tiermodell der MS, so sind die detaillierten
Zielmechanismen sowie die zugrunde liegenden zellulären und molekularen
Mechanismen direkt im ZNS nur unzureichend erklärt. Dies begründet sich unter
anderem darin, dass spezifische Aspekte wie zum Beispiel die Dynamik und
komplexe Kommunikationsvorgänge der Immun- und ZNS-Zellen mit konventionellen
experimentellen Ansätzen nicht vollständig untersucht werden können. Ziel der
Arbeit war es daher, das Migrationsverhalten verschiedener Immunzellsubtypen
im Gehirn mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie zu untersuchen. Diese
Untersuchungen ergaben, dass eine pharmakologische Modulation von T-Zellen
mittels Atrovastatin sowie durch die Aktivierung des Bradykinin-Rezeptors B1
zu einer verringerten Migrationsfähigkeit und Infiltration von lebendem
Hirngewebe führte. Weitere Untersuchungen zeigten zudem, dass sich aktivierte
CD4-positive T-Zellen entlang der Gefäßstruktur im Hirngewebe bewegen, während
CD8-positive Zellen das gesamte ZNS-Parenchym infiltrieren und eine primäre
Gefäßassoziation nicht zu beobachten war. Diese Gefäßassoziation wird über
CXCR4, aber nicht über CCR7 und LFA-1 vermittelt. Obwohl diese Untersuchungen
sehr deutlich zeigen, dass die Zwei-Photonen-Mikroskopie eine wichtige Methode
zur Untersuchung des Immunzellverhaltens im ZNS ist und maßgeblich zur
Aufklärung der Pathogenese beiträgt, so weisen konventionelle Zwei-Photonen-
Laser aufgrund ihres begrenzten Wellenlängenspektrums zwischen 700-1080 nm
Einschränkungen hinsichtlich ihrer Anwendung für die intravitale Zwei-
Photonen-Mikroskopie auf. Deshalb wurde im zweiten Teil der Arbeit der
Einfluss höherer Anregungswellenlängen auf die Bildqualität und auf die
Entwicklung neuer experimenteller Ansätze untersucht. Systematische
Vergleichstudien zeigten, dass eine längerwellige Anregung über 1080 nm
mittels eines optischen parametrischen Oszillators (OPO) zu erhöhten
Eindringtiefen, einer besseren Auflösung in tiefen Gewebsschichten und einer
geringeren Photobleichung führt. Der Schwerpunkt der Untersuchungen lag hier
auf der intravitalen Zwei-Photonen-Mikroskopie zur Untersuchung der
Pathomechanismen im lebenden Organismus. In diesem Zusammenhang konnte gezeigt
werden, dass eine simultane Anregung durch einen konventionellen Zwei-
Photonen-Laser zusammen mit einem OPO, nicht nur die Visualisierung der
Immunzellmigration sondern auch die Visualisierung der Kommunikation der
Immunzellen mit Zellen des ZNS und deren funktionelle Konsequenz in vivo
ermöglicht