For decades geneticist have been investigating the human genome and revealed
that mutations can cause congenital disorders. The current challenge is to
distinguish between pathogenic and nonpathogenic mutations to enable precise
diagnostic and risk estimation as well as to determine the choice of efficient
treatment. Nevertheless, the effect of coding and noncoding mutations is often
not predictable. Therefore, mouse models are needed to verify their
pathogenicity. For many years it was extremely time consuming to recapitulate
human mutations in mice due to enormous cloning efforts. Additionally,
structural variations (SVs) of several hundred kbs could not be generated.
Now, CRISPR/Cas9 allows rapid genome editing by sequence specific induction of
double strand breaks that facilitate structural rearrangements of more than
one Mb and also the integration of point mutations. This work shows that
CRISPR/Cas9 can be used in murine ESC for rapid recapitulation of human
mutations and generation of viable chimeric mice with duplications, deletions
and inversions of several hundred kbs or single nucleotide substitutions.
Both, introducing of SVs and point mutations are marked by variable efficiency
that seem to be caused by locus specific factors. CRISPR/Cas9 was used to
generated six mouse models that helped to verify the pathogenicity of Laf4
truncation, Bhlha9 deletion and Shh duplication while the known pathogenicity
of Bhlha9 duplication could not been proved. The effect of the duplication of
the enhancer hs1428 at the Tbx15 locus and of the Tyr1096Cys mutation in
FNDC3A still remains unclear. Intragenic inframe truncation of LAF4 was found
in a patients presenting Nievergelt-like syndrome that is characterized by
triangular shaped tibia which was recapitulated in mouse by Laf4 truncation
while the Laf4-KO mouse was normal suggesting a dominant gain-offunction
effect of intragenic Laf4 truncation. BHLHA9 duplications are found in many
patient with SHFM or SHFLD. Nevertheless, overexpression of Bhlha9 does not
result in SHFM in mouse. Even the recapitulation of a specific patient
duplication did not cause any limb abnormalities. Thus, it is assumed that
BHLHA9 and/or its interaction network differs between human and mouse.
Contrarily, the deletion of Bhlha9 leads to syndactyly as it was already
published for mouse and human. SHH duplication was found in a patient with
muscle hypertrophy and in another patient with synpolydactyly. The generation
of the corresponding duplication in mouse clearly shows that the tandem
duplication leads to soft tissue hypertrophy and not synpolydactyly. A
duplication of the enhancer hs1428 at the TBX15 locus was found in a case of
radial aplasia. In mouse, the heterozygous recapitulation of the mutation did
not affect skeletal development. Now, homozygous mice are needed to clarify if
the mutation is pathogenic. In a consanguineous family the homozygous
Tyr1096Cys mutation in FNDC3A was found to segregate with recessive SHFM.
Since functional investigation could not detect any changes, a mouse models
was produced that will help to reveal the effect on limb development. The
unsuccessful generation of SHFM in mouse by Bhlha9 duplication shows that
mouse models do not always recapitulate human physiology and developmental
process. Since only disorders with potential regulative pathomechanism could
not be reproduced it is likely that inter species difference on the regulative
level prevents the emergence of the expected phenotype. Consequently, mouse
model can prove the pathogenicity of a mutation but never its insignificance.Durch Jahrzehntelange Forschung am menschlichen Genom ist inzwischen bekannt,
dass Mutationen potentiell Krankheiten verursachen. Für die humangenetische
Diagnostik ist es essentiell pathogene von nicht-pathogenen Varianten zu
differenzieren. Daher ist es problematisch, dass der Effekt von codierenden
und nicht codierenden Mutationen nicht vorhersehbar ist. Um die Pathogenität
zu verifizieren werden humane Mutationen in der Maus reproduziert. Dies war
bisher jedoch sehr aufwendig und dadurch limitiert, dass Struktur
Veränderungen (SVs) von mehreren kbs nicht generiert werden konnten. Das
kürzlich entwickelte CRISPR/Cas9 System erlaubt nun durch sequenzspezifische
Doppelstrangbrüche die exakte Generierung von großen SVs und Punktmutationen.
Diese Arbeit zeigt, dass CRISPR/Cas9 die Generierung von humanen Mutationen
wie Deletionen, Duplikationen, Inversionen bzw. Punktmutationen in murinen
ESCs ermöglicht, aus denen chimäre Mäuse erzeugt werden. Die Effizienz der
Erzeugung von SVs und Punktmutationen hängt jedoch stark von Lokus
spezifischen Faktoren ab. Mit CRISPR/Cas9 wurden sechs unterschiedliche
Mauslinien erzeugt und die Pathogenität der intragenen LAF4 Deletion, der
BHLHA9 Deletion und der SHH Duplikation nachgewiesen. Die bereits bekannte
Pathogenität der BHLHA9 Duplikation konnte das Mausmodel nicht bestätigen. Der
Effekt der Tyr1096Cys Mutation in FNDC3a und der Duplikation des Enhancers
hs1428 am TBX15 Locus ist immer noch unklar. Die intragene inframe-Deletion in
LAF4 wurde in einem Patienten mit Nievergelt-ähnlichem Syndrom gefunden.
Sowohl der Patient als auch das Mausmodel zeigen die typische dreieckige
Verformung der Tibia. Da Laf4-KO keine Extremitätenveränderung verursacht,
wird von einem gain-of-function Mechanismus ausgegangen. Aufgrund von
zahlreichen klinischen Fällen sind BHLHA9 Duplikationen dafür bekannt SHFM
bzw. SHFLD auszulösen. In der Maus haben jedoch weder die Überexpression noch
die Duplikation von Bhlha9 einen Effekt auf die Extremitätenentwicklung. Daher
wird vermutet, dass die Funktionalität des menschlichen BHLHA9 sich vom
murinen Ortholog signifikant unterscheidet. Die Duplikation von SHH wurde in
einem Patienten mit Synpolydactyly gefunden wie auch in einem Fall mit
Muskelhypertrophy. Das entsprechende Mausmodel zeigt jedoch klar, dass die in-
tandem Duplikation zu Hypertrophy von weichem Gewebe und nicht zu
Synpolydactyly führt. Die Duplikation des Enhancer hs1428 am TBX15 Locus wurde
in einem Patienten mit radialer Aplasie gefunden. Die gleiche heterozygote
Mutation hat in der Maus keinen Effekt. Für eine endgültige Beurteilung werden
jedoch homozygote Tiere benötigt. Die Missense Mutation Tyr1096Cys in FNDC3A
segregiert innerhalb einer konsanguinen Familien mit rezessivem SHFM. Da
funktionelle Untersuchungen nicht ausreichten, um die Pathogenität der
Mutation zu beurteilen, wurde sie im Mausmodel nachgestellt. Es lässt sich
jedoch noch keine abschließende Aussage treffen, weil die Tiere noch zur
Homozygotie gezüchtet werden müssen. Obwohl bekannt ist, dass BHLHA9
Duplikationen SHFM erzeugen, konnte dies in der Maus nicht nachgewiesen
werden. Dies verdeutlicht, dass die Maus die humane Physiologie und
Entwicklung nicht perfekt wiederspiegelt. Da vor allem Mutationen mit einem
potentiell regulativen Pathomechanismus in der Maus nicht das menschliche
Krankheitsbild reproduzierten, wird angenommen, dass dies vor allem durch
Spezies bedingte Unterschiede in der Genregulation verursacht wurde. Folglich
ist die Maus ein gutes Model um die Pathogenität von Mutationen nachzuweisen,
jedoch nicht um selbige auszuschließen
