Genotypische und phänotypische Charakterisierung von Vibrio vulnificus Isolaten aus der Umwelt und klinischen Proben der Nordsee- und Ostseeregion

Abstract

Table of Contents ...................................................................................................................... i List of Abbreviations ................................................................................................................ v 1 Introduction ...................................................................................................................... 1 1.1 Taxonomy and Biochemical Characteristics of Vibrio vulnificus ............................... 1 1.2 Ecology of Vibrio vulnificus ........................................................................................ 3 1.3 Disease and Epidemiology of Vibrio vulnificus .......................................................... 6 1.4 Virulence Factors and Pathogenesis of Vibrio vulnificus .......................................... 11 1.5 Enigma of Vibrio vulnificus ....................................................................................... 14 1.6 Clinical versus Environmental Isolates of Vibrio vulnificus ..................................... 15 1.6.1 Multilocus Sequence Typing .............................................................................. 16 1.6.2 16S rRNA ........................................................................................................... 17 1.6.3 Virulence Correlated Gene (vcg) ........................................................................ 17 1.6.4 Mannitol Fermentation and Associated Genes ................................................... 18 1.6.5 pilF ..................................................................................................................... 19 1.6.6 Sialic Acid Catabolism and Biosynthesis ........................................................... 19 1.6.7 Genomic Region XII .......................................................................................... 20 1.7 Aims of the Study ...................................................................................................... 21 2 Publications ..................................................................................................................... 22 2.1 List of Publications and Own Contribution ............................................................... 22 2.2 Publication 1: Genotypic Diversity and Virulence Characteristics of Clinical and Environmental Vibrio vulnificus Isolates from the Baltic Sea Region ...................... 24 2.3 Publication 2: Multiplex PCR for Detection of Virulence Markers of Vibrio vulnificus ................................................................................................................................... 36 2.4 Publication 3: Virulence Profiles of Vibrio vulnificus in German Coastal Waters, a Comparison of North Sea and Baltic Sea Isolates .................................................. 43 2.5 Publication 4: Survey on Antimicrobial Resistance Patterns in Vibrio vulnificus and Vibrio cholerae non-O1/non-O139 in Germany Reveals Carbapenemase-Producing Vibrio cholerae in Coastal Waters ............................................................................. 60 2.6 Publication 5: PVv3, a New Shuttle Vector for Gene Expression in Vibrio vulnificus ................................................................................................................................... 71 3 General Discussion ......................................................................................................... 76 3.1 Background ................................................................................................................ 76 3.2 Genotypic and Phenotypic Characterization of Clinical and Environmental Vibrio vulnificus Isolates from the Baltic Sea Region .......................................................... 77 3.2.1 Resistance to Human Serum .............................................................................. 77 3.2.2 Hemolysis ........................................................................................................... 78 3.2.3 Cytotoxicity to Caco-2 Cells .............................................................................. 80 3.2.4 Detection of Potential Virulence-Associated Genes .......................................... 82 3.2.5 Genotyping of 16S rRNA, vcg and pilF Genes .................................................. 82 3.2.6 Multilocus Sequence Typing .............................................................................. 83 3.2.7 Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry ............................................................................................................................ 84 3.2.8 Estimation of the Pathogenicity Potential of Vibrio vulnificus .......................... 85 3.3 Multiplex PCR for Simultaneous Detection of Putative Pathogenicity Markers of Vibrio vulnificus .................................................................................................... 86 3.4 Prevalence of Virulence-Associated Characteristics among Environmental Vibrio vulnificus Isolates from the North Sea and Baltic Sea ............................................... 86 3.5 Antimicrobial Resistance among Vibrio vulnificus Isolates from German Coastal Waters ........................................................................................................... 87 3.6 Molecular Cloning in Vibrio vulnificus and Potential Applications.......................... 90 4 Summary ......................................................................................................................... 92 5 Zusammenfassung .......................................................................................................... 94 6 References ....................................................................................................................... 96 7 Appendix ....................................................................................................................... 113 7.1 Supplementary Material .......................................................................................... 113 7.1.1 Publication 1 ..................................................................................................... 113 7.1.2 Publication 2 ..................................................................................................... 121 7.1.3 Publication 3 ..................................................................................................... 123 7.1.4 Publication 4 ..................................................................................................... 145 7.2 Publications and Congress Presentations ................................................................ 162 7.3 Eidesstattliche Erklärung ......................................................................................... 164The Gram-negative bacterium V. vulnificus is ubiquitously distributed in coastal and estuarine waters with moderate salinity and sporadically causes severe foodborne or wound infections. Infections with this fast-growing pathogen are rare in Germany. However, forecasts assume a rising occurrence of V. vulnificus in German coastal waters, as well as increasing incidences of infection in the course of climate change. In view of these predictions, fundamental research and characterization of V. vulnificus present in German coastal waters regarding its pathogenic potential is of great importance for public health concerns. Furthermore, methods to identify potentially pathogenic strains of this bacterium are strongly needed to estimate the risk emanating from this pathogen. In this work, the distribution of potential virulence genes, as well as of virulenceassociated pheno- and genotypes was examined in clinical and environmental isolates from the Baltic Sea region to assess their suitability as potential pathogenicity markers. The most promising results were seen for genomic region XII, the nanA gene, and a mannitol fermentation operon, which were found in most clinical and relatively few environmental isolates. Genotypes that are described to correlate with the clinical origin in other studies, such as vcg-type C or 16S rRNA-type B were only rarely detected in clinical isolates from cases of the Baltic Sea region. However, these genotypes are strong indicators for phylogenetic lineages with a high pathogenicity potential. Phenotypic traits associated with virulence of V. vulnificus, such as resistance to human serum, strong hemolytic activity or cytotoxicity were exhibited by most isolates, underlining the destructive character of this pathogenic species. The results led to the development and validation of a multiplex PCR that allows simultaneous amplification of genomic region XII, the nanA gene, the mannitol fermentation operon, as well as of the vcg-type C and 16S rRNA-type B alleles. The prevalence of these potential pathogenicity markers was investigated in recent environmental isolates from the Baltic Sea as well as the North Sea. Together with phylogenetic analyses using multilocus sequence typing, this study showed that V. vulnificus populations in both areas vary considerably. The majority of North Sea isolates have to be considered as potential risk for human infection, although no V. vulnificus infections have been reported from this region so far. Therefore, increased awareness of this pathogen is needed in both, the Baltic Sea as well as the North Sea area, especially in summer when exposition to the pathogen is at its highest. The characterization of V. vulnificus isolates was complemented by investigations on antimicrobial resistance patterns. All V. vulnificus isolates - irrespective of their origin - were susceptible to clinically relevant agents, such as tetracyclines, third-generation cephalosporins, and fluoroquinolones. No multidrug resistance was observed. Reduced susceptibility was exclusively found for streptomycin, which might be the result of an intrinsic resistance. Finally, the applicability of a newly designed shuttle vector for molecular cloning in Vibrio spp. was demonstrated. The developed system represents an efficient tool for functional analyses of putative virulence genes.V. vulnificus ist ein Gram-negatives Bakterium, das ubiquitär in Küstengewässern und Ästuarien mit mäßigem Salzgehalt verbreitet ist und schwere Lebensmittel- und Wundinfektionen verursachen kann. Infektionen mit diesem schnell wachsenden Bakterium sind selten in Deutschland. Im Zuge des Klimawandels wird jedoch sowohl mit einem Anstieg des Vorkommens von V. vulnificus in deutschen Küstengewässern als auch mit einer steigenden Inzidenz an Infektionen gerechnet. In Anbetracht dieser Vorhersagen ist die grundlegende Untersuchung und Charakterisierung von V. vulnificus Isolaten in deutschen Küstengewässern in Bezug auf deren pathogenes Potential von großer Bedeutung für die öffentliche Gesundheit. Darüber hinaus werden dringend Methoden benötigt, die die Identifizierung von pathogenen Stämmen ermöglichen, um das von diesen Bakterien ausgehende Gesundheitsrisiko beurteilen zu können. In dieser Arbeit wurde das Vorkommen mögliche Virulenzgene und virulenzassoziierter Phäno- und Genotypen in klinischen Isolaten und Umweltisolaten der Ostseeregion untersucht, um ihre Eignung als potentielle Pathogenitätsmarker einzuschätzen. Die aussichtsreichsten Ergebnisse zeigten Untersuchungen der genomischen Region XII, des Gens nanA und des Mannitol Fermentations Operons. Diese Gene/Genregionen waren in den meisten klinischen Isolaten, aber nur in verhältnismäßig wenigen Umweltisolaten zu finden. Genotypen, die laut Literatur mit dem klinischen Ursprung von V. vulnificus Isolaten korrelieren sollten, wie z.B. der vcg-Typ C oder der 16S rRNA-Typ B, wurden nur selten in klinischen Isolaten aus dem Ostseeraum nachgewiesen. Jedoch deuten diese Genotypen stark auf eine Zugehörigkeit zu phylogenetischen Linien mit hohem Pathogenitätspotential hin. Die meisten Isolate wiesen phänotypische Merkmale auf, die mit der Virulenz von V. vulnificus assoziiert werden. Die weit verbreitete Resistenz gegenüber humanem Serum sowie die starke hämolytische Aktivität und Zytotoxizität heben den stark destruktiven Charakter dieser Spezies hervor. Die Ergebnisse legten die Entwicklung und Validierung einer Multiplex PCR nahe, die die simultane Amplifikation der genomischen Region XII, des Gens nanA, des Mannitol Fermentations Operons und der vcg-Typ C und 16S rRNA-Typ B Allele erlaubt. Schließlich wurde das Vorkommen dieser potentiellen Pathogenitätsmarker in kürzlich isolierten Umweltstämmen aus der Nordsee und Ostsee untersucht. Zusammen mit den phylogenetischen Analysen mittels Multilokus-Sequenz-Typisierung zeigten diese Untersuchungen, dass sich die V. vulnificus Populationen in beiden Regionen wesentlich unterscheiden. Obwohl bisher noch keine Infektionen aus dem Nordseeraum berichtet wurden, geht von den in dieser Studie untersuchten Nordseeisolaten ein potentielles Risiko für humane Infektionen aus. Daher ist erhöhte Aufmerksamkeit für die Gesundheitsrisiken dieses pathogenen Erregers im Ostseeraum und Nordseeraum geboten. Dies gilt besonders in den Sommermonaten, wenn die Exposition mit diesem Bakterium am größten ist. Die Charakterisierung der V. vulnificus Isolate wurde durch Antibiotikaresistenzuntersuchungen ergänzt. Alle V. vulnificus Isolate - unabhängig von deren Ursprung - waren empfindlich gegenüber klinisch relevanten antimikrobiellen Substanzen, wie z.B. Tetrazyklinen, Cephalosporinen der 3. Generation und Fluorochinolonen. Es traten keine Multiresistenzen auf und geringere Empfindlichkeit wurde nur gegenüber dem Aminoglycosid Streptomycin beobachtet, wobei es sich hierbei um eine intrinsische Resistenz handeln könnte. Schließlich wurde die Anwendbarkeit eines neu konstruierten “Shuttle”-Vektors für die effiziente Klonierung von Vibrio Spezies nachgewiesen. Das entwickelte Klonierungssystem stellt damit ein effizientes Werkzeug für funktionelle Analysen potentieller Virulenzgene dar