Coiled-Coil-Peptide als multivalentes Gerüst für Kohlenhydrate: von Rezeptor-
Targeting zum Impfstoff durch Ausnutzung von Zucker-Protein-Wechselwirkungen
Over the past decade, the employment of chemically-synthesized scaffolds for
the delivery of biologically-relevant molecules has proven to be a highly
advantageous strategy for medicinal purposes, primarily due to stabilization
of the cargo and enhancement of site-targeted therapeutic effects. Conjugation
to a scaffold has been shown to reduce ligand degradation, impart optimal
geometric conformation and increase the likelihood of the active species
reaching the target. A wide range of synthetic carriers, including dendrimers,
nanoparticles, PNAs, LNAs and cell-penetrating peptides, has been explored;
among these, peptides are of particular interest due to their diverse
functional groups, folding properties, biocompatibility and low toxicity. In
particuar, the structural simplicity and regularity of the α-helical
coiledcoil folding motif makes it a suitable scaffold for multivalent ligand
display. By changing only a few positions in a coiled-coil sequence, it is
possible to influence the behaviour of the resulting helices, obtaining either
short dimeric peptides or long, fiber-forming carriers. This thesis explores
the coiled-coil motif as a scaffold for the multivalent display of peptide and
carbohydrate ligands. We aspired to demonstrate the versatility of the coiled-
coil motif in two distinct projects. The first study relied on the dimeric
form, providing structural predictability for the rational presentation of
carbohydrates for lectin targeting. The second study aimed to increase the
efficiency of carbohydrate-antibody recognition by displaying ligands on a
self-assembling, fiber-forming peptide. The first project is entitled
“Tailored presentation of carbohydrate ligands on a coiled-coil scaffold for
asialoglycoprotein receptor targeting”. In this work, we determined the
binding of members of a coiled-coil glycopeptide library to hepatocytes and
established the optimal distance and orientation of the galactose moieties for
interaction with the asialoglycoprotein receptor using flow cytometry. We
confirmed that binding occurs through receptor-mediated endocytosis via
inhibition studies with cytochalasin D; moreover, fluorescence microscopy
studies demonstrated the uptake of the carrier peptides into cells. The second
project is entitled “A self-assembling peptide scaffold for the multivalent
presentation of antigens”. Here, a coiled coil-based sequence was used to
create tunable higher-order structures on the nanometer scale, allowing for
the multivalent presentation of a mannose moiety and a peptide epitope, the
presence of which did not interfere with selfassembly of the nanostructure.
The multivalent display of these ligands led to tighter binding by both
mannose-specific lectins and appropriate antibodies. The potential of the
novel selfassembling peptide to display antigens in bioanalytical assays that
demand high sensitivity was illustrated by decoration with a disaccharide
glycotope from the surface of the Leishmania parasite. Anti-Leishmania
antibodies present in human and canine sera bind their antigen more
effectively in the case of multivalent display on the coiled-coil scaffold. In
summary, the α-helical coiled-coil scaffolds investigated here were shown to
effectively multivalently present carbohydrate and/or peptide ligands to their
specific binding partners, in the context of either a well-defined precision
tool (project 1) or self-assembled nanofibers (project 2). Project 1
demonstrated that a coiled-coil carrier decorated with selected ligands may be
tailored-made for applications involving other therapeutically-relevant
receptors. Project 2 established that a synthetically accessible fiber-forming
coiled-coil scaffold can provide the multivalent effect required to enhance
binding avidity of specific antibodies and/or receptors.In den letzten Jahren stellt die Anwendung von synthetischen Gerüsten für den
Transport biologisch relevanter Moleküle eine vorteilhafte Strategie in der
Medizin dar. Dabei wird nicht nur der Wirkstoff stabilisiert sondern auch noch
zusätzlich die Wirkungsweise am Zielort moduliert. Es konnte gezeigt werden,
dass durch die Konjugation einer biologisch aktiven Spezies an ein Gerüst
deren Stabilität erhöht wird, die optimale geometrische Konformation
vermittelt wird und generell eine Erhöhung der Wahrscheinlichkeit auf ein
Erreichen des Wirkstoffes am Wirkungsort stattfindet. Zu diesem Zweck wurden
unterschiedlichste synthetische Träger untersucht wie zum Beispiel:
Dendrimere, Nanopartikel, PNAs, LNAs und zellpenetrierende Peptide. In diesem
Kontext stehen Peptide im besonderen Fokus der Forschung aufgrund ihrer
zahlreichen funktionellen Gruppen, ihres vielfältigen Faltungsverhalten und
ihrer Biokompatibilität sowie geringen Toxizität. Ein prominenter Vertreter,
das α-helikale coiled-coil Faltungsmotif, ermöglicht durch seine strukturelle
Einfachheit und Regelmäßigkeit die multivalente Präsentation von Liganden.
Durch die Modifikation von wenigen Positionen in einem coiled-coil Motiv ist
es möglich, einen Einfluss auf das Oligomerisierungsverhalten der
resultierenden Helices auszuüben, wodurch entweder kurze Peptiddimere oder
lange fibrillenartige Gerüste erhalten werden. Die vorliegende Arbeit
untersucht die Möglichkeit das coiled-coil Motif als ein Gerüst für die
multivalente Präsentation von Kohlenhydraten oder Peptiden zu verwenden. Dazu
ist es angedacht den Vorteil des coiled-coil Motifs in zwei unterschiedlichen
Projekten zu demonstrieren. Im ersten Projekt wird die Dimer-Form genutzt, die
eine strukturelle Vorhersagbarkeit besitzt um eine rationale Präsentation von
Kohlenhydraten für eine Lektin-Interaktion zu ermöglichen. Die zweite Studie
zielt auf eine Erhöhung der Effizienz einer Kohlenhydrat-Antikörper-Erkennung
durch die Ligandenpräsentation auf einem selbstorganisierenden Fibrillen
bildenden Peptid ab. Das erste Projekt heißt “Tailored presentation of
carbohydrate ligands on a coiled-coil scaffold for asialoglycoprotein receptor
targeting”. In diesem Teil konnte die Bindung der Mitglieder einer coiled-coil
Glykopeptid-Bibliothek zu Heptazyten bestimmt werden und der optimale Abstand
sowie die Orientierung der Galactose-Liganden für die Wechselwirkung mit dem
Asialoglykoproteinrezeptor (ASGPR) durch Druchflusszytomerie etabliert werden.
Anhand von Inhibitionsstudien mit Cytochalasin D wurde bestätigt, dass die
Bindung durch die ASGPR vermittelte Endozytose abläuft. Darüber hinaus wurde
die Aufnahme der Trägerpeptide in die Zelle mithilfe von fluoreszenz-
mikroskopischen Studien nachgewiesen. Im zweiten Teil mit dem Namen “A self-
assembling peptide scaffold for the multivalent presentation of antigens”
wurde ein coiled-coil-basierende Sequenz genutzt um veränderbare
höhergeordnete Strukturen im Nanometerbereich zu generieren. Diese
ermöglichten die gleichzeitige Präsentation von Mannose-Liganden und einem
Peptid-Epitop, wobei die Selbstorganisation der Helices durch die
Modifikationen nicht beeinträchtigt wurde. Die multivalente Präsentation
dieser Liganden resultierte in einer stärkeren Bindung durch einerseits
Mannose-bindende Lektine und andererseits durch geeignete Antikörper.
Weiterhin wurde das Potential dieses neuartigen selbstorganisierenden Peptids
untersucht, die eingebauten Antigene in einem bioanalytischen Assay zu
präsentieren, welcher einer hohen Empfindlichkeit bedarf. Dazu wurde das
Peptid mit einem Disaccharid-Glykotop vom Leishmania Parasit versehen und mit
humanen und caninen anti-Leishmania-Antikörpern enthaltenden Seren inkubiert.
Die Bindung des Antigens durch die Antikörper erfolgte im Falle der
multivalenten Präsentation durch das coiled-coil Gerüst weitaus effektiver.
Zusammenfassend wiesen die in der vorliegenden Arbeit untersuchten α-helikalen
coiled-coil Gerüste eine effiziente multivalente Präsentation von
Kohlenhydraten und/ oder Peptiden für die entsprechenden spezifisch bindenden
Partner auf. Dies wurde entweder durch ein gut definiertes Präzisionswerkzeug
(Projekt1) oder durch Selbstorganisierenden Nanofasern (Projekt 2) erzielt. In
Projekt 1 wurde dargelegt, dass coiled-coil Peptide, welche mit ausgewählten
Liganden versehen sind, für die Anwendung zur Untersuchung von therapeutisch
relevanten Rezeptoren maßgeschneidert synthetisiert werden können. Im Projekt
2 wurde gezeigt, dass synthetisch zugängliche Fibrillen bildende coiled-coil
Gerüste einen multivalenten Effekt aufweisen, welcher für eine Verstärkung der
Bindung eines spezifischen Antikörpers und/ oder Rezeptors erforderlich ist
