Table of contents I 1 Abstract 1 2 Zusammenfassung 2 3 Introduction 3 3.1
Structure and function of striated muscles 3 3.1.1 Myofibrillogenesis 3 3.1.2
Structure and function of the sarcomere 5 3.2 Titin 6 3.2.1 Titin isoforms 7
3.2.2 Titin binding proteins 9 3.3 Clinical relevance 15 3.3.1 Titin mutations
in cardiomyopathies 15 3.3.2 Titin mutations in muscular dystrophies 17 3.4
Aims of the study 18 4 Material and methods 20 4.1 Material 20 4.1.1 Chemicals
and kits 20 4.1.2 Enzymes 20 4.1.3 Oligonucleotides 21 4.1.4 Antibodies 23
4.1.5 Equipment 24 4.1.6 Software 25 4.2 Methods 25 4.2.1 Animal procedures
and experiments 25 4.2.2 Molecular methods 27 4.2.3 Biochemical methods 33
4.2.4 Histological methods 37 4.2.5 Bioinformatics 39 4.2.6 Statistical
analysis 39 5 Results 40 5.1 Generation and validation of the titin Ex2
knockout (TiEx2MCK) 40 5.1.1 Generation of the titin exon 2 knockout 40 5.1.2
Validation of Ex2 knockout 42 5.2 Generation and validation of the titin M
band knockout (TiMexMCK) 45 5.2.1 Generation of the M band knockout 45 5.2.2
Validation of the M band knockout 46 5.3 Comparative phenotyping of the Ex2
and the M band knockout 49 5.3.1 Skeletal muscle phenotypes 49 5.3.2 Cardiac
phenotypes 57 5.3.3 Analysis of the Ex2 and M band knockout transcriptome 63
5.4 Analysis of the Ex2 and M band knockout proteome 66 6 Discussion 75 6.1
Genetic approaches towards understanding titin biology 75 6.2 Titin deletions
lead to skeletal and cardiac abnormalities 77 6.2.1 Sarcomeric disassembly
results in skeletal muscular atrophy 79 6.2.2 Disruption of the sarcomere
structure affects cardiac development 87 6.3 Conclusions and perspectives 103
7 Bibliography 109 8 Abbreviations 129 9 List of figures 135 10 List of tables
137 Acknowledgement 138 Curriculum vitae 140Titin forms a continuous filament along the myofibril and is essential for the
development, the maintenance and the passive stiffness of the sarcomere. It
contains the cardiac specific elastic N2B, and differentially spliced elastic
PEVK region, as well as a titin kinase domain. Mutations of titin have been
associated with severe cardiac and skeletal myopathies such as dilated
cardiomyopathy (DCM) or hereditary myopathy with early respiratory failure
(HMERF). To understand the role of titin’s functional domains in striated
muscle health and disease, we created diverse knockout mice (KO). They
demonstrated the importance of M band titin for the structural integrity of
the sarcomere and the relation of the N2B and PEVK domains to cardiac trophic
signaling and ventricular filling. To eliminate the holoprotein, we have
generated a complete Titin knockout (TiEx2MCK) flanking the exon containing
the ATG with lox sites and expressing the CRE recombinase in striated muscle.
The comparison of the Z-disc to the M band KO mouse included phenotypic,
morphologic, ultrastructural, transcriptomic and proteomic analyses. Both KO
models developed a severe skeletal muscle atrophy caused by the disassembly of
the sarcomere which led to a decreased body weight, strength endurance, and
survival. The same sarcomere disassembly was present in cardiomyocytes of both
models but led to the development of DCM in the TiEx2MCK KO whereas M band
titin deficiency led to cardiac atrophy. These cardiac abnormalities can
contribute to the decreased survival of the Z-disc KO animals. The proteomic
analysis of both KO models revealed the differential expression of atrophy and
hypertrophy associated proteins such as FHL2. We concluded that in both animal
models, the skeletal muscle atrophy was caused by sarcomere disassembly, which
also contributed to the cardiac phenotype. Additionally, titin’s N-terminus
affects trophic signaling in the heart. This study validated titin’s role as
an essential sarcomeric protein that does not only serve as an elastic
scaffold, but also contributes to the regulation of striated muscle size.Titin bildet ein kontinuierliches Filament entlang der Myofibrille und ist
wichtig für den Aufbau, den Erhalt und die passive Steifheit des Sarkomeres.
Das Protein enthält die herzspezifische elastische N2B Domäne und die
differenziell gespleiβte PEVK-Region, sowie eine Kinase-Domäne. Titin-
Mutationen können zu schweren Herz- und Skeletmuskel-Erkrankungen wie
dilatative Kardiomyopahtie oder der hereditären Myopathie mit frühem
respiratorischem Fehler (HMERF) führen. Um die Rolle der unterschiedlichen
Titindomänen in Funktion und Erkrankung der gestreiften Muskulatur zu
untersuchen, haben wir unterschiedliche Knockout Mausmodelle generiert. Diese
demonstrierten die Relevanz der M Bande für die strukturelle Integrität des
Sarkomeres und die Rolle der N2B- and PEVK Domänen in der kardialen
trophischen Reizweiterleitung und der Füllung des Ventrikels. Um das
Gesamtprotein zu entfernen, haben wir das ATG-Exon mit lox
Rekombinationssequenzen flankiert und die Cre Rekombinase in gestreiftem
Muskel exprimiert (TiEx2MCK). Der Vergleich der Z Scheiben- und M-Banden-
Knockout- Maus umfasste phänotypische, morphologische, ultrastrukturelle,
transkriptomische und proteomische Analysen. Beide KO-Modelle entwickelten
eine schwere Skeletmuskelatrophie die durch eine Auflösung der
Sarkomerstruktur verursacht wurde und zu Gewichtsverlust, reduzierter
Kraftausdauer und hoher Mortalität führte. Die Auflösung der Sarkomerstruktur
betraf gleichermassen Kardiomyozyten beider KO Modelle, führte jedoch zur
Ausbildung einer DCM im TiEx2MCK KO und einer kardialen Atrophie bei titin M
Banden Defizienz. Diese kardialen Veränderungen können zur erhöhten Mortalität
der Z Scheiben KO Tiere beitragen. Die Analyse des Proteoms beider KO Modelle
zeigte die differenzielle Expression von Atrophie- und Hypertrophy
assoziierten Proteinen wie FHL2. Entsprechend scheint die Skeletmuskelatrophie
vorwiegend durch den Zusammenbruch der Sarkomerstruktur ausgelöst zu werden,
die ebenfalls zum kardialen Phänotyp beiträgt. Zusätzlich führt der Verlust
des Titin N Terminus zu veränderter trophischer Signaltransduktion im Herzen.
Diese Studie validierte Titins Rolle als essentielles Sarkomerprotein, welches
nicht nur als elastisches Gerüst fungiert, sondern auch an der Regulation des
Wachstums der gestreiften Muskulatur beteiligt ist
