Ljungan virus (LV) is a member of the Picornaviridae that was isolated from
various species of voles and mice in Scandinavia, North America, and Italy,
suggesting a wide host range and a world wide distribution of this virus. LV
causes severe disease in its rodent reservoirs, such as diabetes and
myocarditis. In addition, laboratory mice infected with LV suffer from
encephalitis and fetal deaths indicating that LV might also induce this
diseases in the wild. In addition, LV has been associated with human disease
during pregnancy and of neonates, respectively. A real-time RT-PCR assay was
established to identify and quantify LV in different types of sample. The
method was evaluated using in vitro transcribed RNA and RNA extracted from
cell culture supernatant and LV infected laboratory mice, respectively. The
assay was specific to all known LV strains, but not to closely related
picornaviruses. A linear detection range with high sensitivity (106 - 101 in
vitro transcribed RNA molecules) was demonstrated. Furthermore, a melting
curve analysis, pyrosequencing and a RT PCR assay targeting the LV VP1 region
were established for characterisation and genotyping of LV positive samples. A
panel of 22 monoclonal antibodies (mAbs) against LV genotypes 1 and 2 were
produced by immunization of BALB/c mice with whole virus. Thirteen mAbs were
class IgG antibodies and nine were class IgM antibodies, all contained kappa
light chains. All mAbs were reactive by capture enzyme-linked immunosorbent
assay and indirect immunofluorescent assay. In addition, 5 mAbs showed a
positive staining in immunohistochemistry. No mAb bound to denatured capsid
proteins as detected by immunoblotting. In contrast, the target capsid
protein(s) of 20 mAbs were identified by immunoprecipitation, revealing the
conformational nature of epitopes required for mAb binding. Furthermore, 7
mAbs were identified that inhibited LV infection to cell culture. Assays
developed in this thesis should provide usefool tools for the development of
diagnostic assays and the investigation of LV properties and its pathogenesis.
Three different strains of laboratory rats were investigated for the presence
of LV. LV specific RNA was found in brain and heart by RT-PCR. In addition, LV
proteins were visualised in the pancreas by immunohistochemistry and specific
antibodies were detected by indirect immunofluorescence test, suggesting that
the laboratory rat is one of several rodent reservoirs of this new
picornavirus. Wild rodents from Germany and Thailand were investigated for LV
presence by RT PCR. In total, 454 (Germany) and 87 samples (Thailand),
respectively, were analysed. A total of 44 (9.7 %) (Germany) and 14 (16.1 %)
(Thailand) samples were positive for LV, belonging to the following species:
Germany: Microtus agrestis, Microtus arvalis, Myodes glareolus, Apodemus
agrarius, Apodemus flavicollis, Apodemus sylvaticus, Micromys minutus, Mus
musculus, Rattus norvegicus; Thailand: Bandicota indica, Bandicota savilei,
Mus caroli, Rattus rattus, Tupaia glis. LV positive animals were found in the
German areas of Baden-Württemberg, Saxony-Anhalt, Brandenburg, Mecklenburg-
Western Pomerania, the city of Cologne, and Thai provinces Bangkok, Buri Nam,
and Prachuap Khiri Khan. A putative new LV genotype was found in a bank vole
sample from Germany. The data present a so far unknown picture of LV
prevalence in wild rodents also in Central Europe and Asia. In this thesis,
organs of laboratory mice infected with LV were investigated for the presence
of LV genome by real-time RT-PCR through time. The animals had clinical signs
of encephalitis a few days post infection and developed diabetes later in
life. All organs were found positive for LV over the whole period of 174 days.
This work shows that LV causes a systemic persistent infection in laboratory
mice that might support the onset of diabetes in adult individuals. Bank voles
trapped in the wild were investigated for the presence of LV by real-time RT-
PCR. Several organs were found positive with copy numbers close to those found
in laboratory mice during persistent infection, indicating a systemic
persistent LV infection also in wild bank voles. LV production was analysed in
two cell lines. Both Vero B4 and BHK 21 cells were susceptible for LV
infection. An increase of LV RNA and LV protein was detected in both cell
lines. In contrast, only Vero B4 cell supernatant had an increasing titer of
LV particles, indicating LV infection of BHK 21 cells is restricted.
Furthermore, only Vero B4 cells showed a clear cytopathic effect post LV
infection that was associated with induction of apoptosis. Apoptosis might
play a role in LV induced onset of encephalitis, myocarditis, and diabetes,
respectively.Ljunganvirus (LV) gehört zur Familie der Picornaviridae und wurde in
verschiedenen Wühlmaus- und Mausspezies in Skandinavien, Nordamerika und
Italien nach-gewiesen, was ein breites Wirtsspektrum sowie eine weltweite
Verbreitung dieses Virus vermuten lässt. LV verursacht ernsthafte
Erkrankungen, wie Diabetes und Myokarditis, in seinen Nagerreservoiren. LV
infizierte Labormäuse entwickeln zudem neurologische Symptome und reproduktive
Störungen. Diese Erkrankungen könnten ebenfalls bei Wildtieren durch LV
induziert werden. Der Nachweis von LV im Menschen wurde mit Erkrankungen
während der Schwangerschaft und von Neugeborenen assoziiert. In dieser Arbeit
wurde eine real time RT PCR Methode etabliert, um LV in verschiedenem
Probenmaterial nachzuweisen und zu quantifizieren. Die Methode wurde mittels
in vitro transkribierter RNA, RNA aus Zellkulturüberständen und RNA aus LV
infizierten Labormäusen evaluiert. Die RT PCR war spezifisch für alle
bekannten LV Stämme, nicht jedoch für eng verwandte Picornaviren. Ein linearer
Nachweisbereich mit hoher Sensitivität (106 - 101 in vitro transkribierte RNA
Moleküle) konnte gezeigt werden. Für eine weitere Charakterisierung LV
positiver Proben wurden eine Schmelzpunktanalyse, Pyrosequencing sowie eine RT
PCR Methode zum Nachweis der LV VP1 Region etabliert. Ein Panel von 22
monoklonalen Antikörpern (mAk) wurde durch Immunisierung von BALB/c Mäusen mit
Vollvirus produziert. Dreizehn mAk gehörten zur IgG Subklasse und neun mAk zur
IgM Subklasse. Alle mAk waren positiv in einem capture enzyme linked
immunosorbent assay und im Immunfluoreszenztest. Fünf der mAk detektierten
ebenfalls LV Antigen in der Immunhistochemie. Keiner der mAk konnte
denaturierte LV Kapsidproteine nachweisen, wohingegen die Interaktionspartner
von 20 mAk durch Immunpräzipitation identifiziert werden konnten, was darauf
schließen lässt, dass die mAk an Konformationsepitope der LV Kapsidproteine
binden. Zusätzlich wurden sieben neutralisierende mAk identifiziert. Die in
dieser Arbeit etablierten Methoden bieten die Grundlage für die Entwicklung
diagnostischer Methoden zum LV Nachweis. Die Erforschung der biochemischen und
physikalischen Eigenschaften des LV und der LV Pathogenese sollte mit Hilfe
dieser Methoden gezielt durchgeführt werden können. Drei verschiedene
Laborratten-Stämme wurden auf eine LV Infektion untersucht. LV spezifische RNA
wurde mittels RT PCR in Hirnen und Herzen der Tiere nachgewiesen. LV Proteine
wurden zudem im Pankreas infizierter Tiere mit Hilfe der Immunhistochemie
gezeigt und spezifische anti LV Antikörper wurden durch einen
Immunfluoreszenztest nachgewiesen. Diese Daten legen nahe, dass Laborratten
eines von mehreren Nagerreservoiren für LV sind. In einem weiteren Projekt
wurde die LV Prävalenz in Wildnagern aus Deutschland und Thailand untersucht.
Insgesamt wurden 454 Tiere aus Deutschland und 87 Tiere aus Thailand mittels
RT PCR getestet. Aus Deutschland waren 44 (9,7 %) Proben und aus Thailand 14
(16,1 %) Proben LV positiv. Folgende Spezies wurden LV positiv getestet:
Deutschland: Microtus agrestis, Microtus arvalis, Myodes glareolus, Apodemus
agrarius, Apodemus flavicollis, Apodemus sylvaticus, Micromys minutus, Mus
musculus, Rattus norvegicus; Thailand: Bandicota indica, Bandicota savilei,
Mus caroli, Rattus rattus, Tupaia glis. LV positive Tiere wurden in folgenden
Regionen gefunden: Baden-Württemberg, Sachsen-Anhalt, Brandenburg,
Mecklenburg-Vorpommern, Köln (Deutschland), Bangkok, Buri Nam und Prachuap
Khiri Khan (Thailand). Ein vermutlich neuer LV Genotyp wurde in einer
Rötelmausprobe aus Deutschland detektiert. Diese Daten repräsentieren eine
bisher unbekannte Verbreitung von LV auch in Zentraleuropa und Asien. Organe
von LV infizierten Labormäusen wurden im Zeitverlauf mittels real-time RT PCR
auf LV-Präsenz untersucht. Die Tiere erkrankten wenige Tage nach der Infektion
an einer Enzephalitis und entwickelten im späteren Verlauf klinische Symptome
eines Diabetes. Alle Organe waren über den gesamten Zeitverlauf von 174 Tagen
LV positiv. Es konnte somit gezeigt werden, dass LV eine systemische
persistierende Infektion verursacht, die zum Ausbruch von Diabetes in
erwachsenen Tieren beitragen dürfte. Organe von in der Wildnis gefangenen
Rötelmäusen wurden ebenfalls getestet. Verschiedene Organe waren LV positiv.
Die Anzahl der LV Kopien war dabei vergleichbar mit denen aus Labormäusen
während der persistierenden Infektion, was darauf hinweist, dass LV auch in
Wildnagern persistiert. Die LV-Produktion wurde in zwei verschiedenen
Zellinien untersucht. Sowohl Vero B4 als auch BHK 21 Zellen waren für eine LV
Infektion empfänglich. In beiden Zellinien wurde eine Zunahme von LV RNA und
LV Protein im Zeitverlauf beobachtet. Ein ansteigender Virustiter konnte
allerdings nur im Überstand von Vero B4 Zellen detektiert werden. Weiterhin
wurde lediglich in Vero B4 Zellen ein virusinduzierter cytopathischer Effekt
beobachtet, welcher durch Apoptose induzierende Effekte ausgelöst scheint. LV
induzierte Apoptose könnte eine Rolle in der Entstehung von Enzephalitis,
Myokarditis und Diabetes spielen
