The proteoglycan agrin is an integral part and of utmost importance in the
development and maintenance of the neuromuscular junction of vertebrates. Even
though it is expressed at developmental stages in the central nervous system
its role in synaptogenesis is currently unknown. By employing the whole cell
patch clamp technique agrin’s effect on the synaptogenesis of cortical neurons
in microisland and conventional monolayer cultures was investigated in this
thesis. In microisland cultures of single cortical neurons excitatory and
inhibitory neurons could be investigated separately. Incubation with soluble
agrin for three to five hours led to a robust increase in mEPSC frequency and
amplitude in these cultures. Neurotransmitter release and the number of
excitatory synapses were investigated. The paired-pulse ratios of agrin-
treated cells remained unchanged but the current amplitudes were larger after
agrin incubation. Studies on the co-localization of VGlut1+2 and PSD95 showed
that treatment with soluble agrin increased the number of co-localized puncta.
Stainings with antibodies against AMPAR revealed a larger area of AMPAR
clusters and more AMPAR/VGlut1+2 co-localized puncta in agrin-treated cells
opposed to VGlut1+2 positive areas. This observation explains the increase in
mEPSC amplitude and frequency by an increased number of AMPAR-containing
excitatory synapses. Endogenous agrin and the presence of the agrin receptor
LRP4 are necessary to induce the increase in mEPSC frequency since LRP4- and
agrin-deficient neurons were unable to react to agrin treatment demonstrating
the importance of these proteins. The mechanism behind this increase was shown
to be related to PI3K/mTOR signaling. Incubation with neuronal agrin led to
increased phosphorylation of GSK3β in immunostainings of single cortical
neurons and blocking PI3K/mTOR with wortmannin, LY293002 or rapamycin
abolished agrin-mediated effects on the increase of the mEPSC frequency. The
data suggest that agrin might influence synaptogenesis in cortical neurons by
activating PI3K/mTOR signaling leading to the formation of new excitatory
synapses. In contrast to microisland cultures conventional monolayer cultures
of neurons showed an increase in the frequency of mIPSCs after treatment with
soluble agrin for three to five hours. This effect was time and concentration
dependent. However changes in the release probability of neurotransmitters and
changes in the number of inhibitory synapses were not discovered. Paired-pulse
ratios were unaffected by agrin treatment as well as the number of inhibitory
synapses. The analysis of agrin-deficient neurons showed no increase in mIPSC
frequency after agrin treatment suggesting that endogenous agrin important for
proper signal transduction. In summary microisland cultures are a suitable
tool to investigate synaptogenesis with electrophysiological and
immunocytochemical methods. Using this experimental approach, this study
demonstrated that agrin is important during synaptogenesis or synapse
maintenance in cortical neurons but not essential.Das Proteoglykan Agrin ist ein integraler Bestandteil von äußerster
Wichtigkeit bei der Entwicklung und Aufrechterhaltung der neuromuskulären
Endplatte von Vertebraten. Obwohl es auch während der Entwicklung des
zentralen Nervensystems exprimiert wird, ist seine Rolle in der Synaptogenese
noch ungeklärt. Mit Hilfe der whole-cell Patch-Clamp-Technik wurde die Wirkung
von Agrin bei der Synaptogenese von kortikalen Neuronen in microisland und
konventionellen Kulturen in dieser Arbeit untersucht. In microisland Kulturen
konnten einzelne exzitatorische sowie inhibitorische Neurone getrennt
voneinander untersucht werden. Inkubation mit löslichem Agrin führte in diesen
Kulturen zu einem robusten Anstieg der mEPSC Frequenz und ihrer Amplitude. Die
Neurotransmitterausschüttung und die Anzahl der exzitatorischen Synapsen wurde
untersucht. Das Paired-pulse-Verhältnis blieb unverändert verglichen mit
unbehandelten Kontrollneuronen aber die Stromamplituden waren größer nach der
Inkubation mit Agrin. Kolokalisationsstudien von Vglut1+2 und PSD95 zeigten
einen Anstieg der kolokalisierten Puncta nach der Behandlung mit löslichem
Agrin. Färbungen mit Antikörpern gerichtet gegen AMPAR offenbarten eine
größere Fläche von AMPAR-Anhäufungen gegenüberliegend von VGlut1+2 positiven
Arealen sowie mehr kolokalisierte AMPAR/VGlut1+2 puncta in Agrin-behandelten
Zellen. Diese Beobachtung erklärt den Anstieg der mEPSC Frequenz und Amplitude
durch eine erhöhte Anzahl an AMPAR-enthaltenden exzitatorischen Synapsen.
Endogenes Agrin und das Vorhandensein des Agrinrezeptors LRP4 sind notwendig,
um den Anstieg der mEPSC-Frequenz zu induzieren, da LRP4- und agrindefiziente
Neurone nicht in der Lage waren auf die Agrinbehandlung zu reagieren, was die
Wichtigkeit dieser Proteine unterstreicht. Der Mechanismus der hinter diesem
Anstieg liegt ist verbunden mit dem PI3K/mTOR Signalweg. Die Inkubation mit
löslichem Agrin führte zu einer erhöhten Phosphorylierung von GSK3β in
Immunfärbungen von einzelnen kortikalen Neuronen und die Blockade von
PI3K/mTOR mit Wortmannin, LY294002 oder Rapamycin hob den Agrin-vermittelten
Effekt auf die Zunahme der mEPSC Frequenz auf. Diese Daten lassen vermuten,
dass Agrin einen Einfluss auf die Synaptogenese in kortikalen Neuronen durch
die Aktivierung des PI3K/mTOR Signalwegs ausübt und zur Bildung neuer
exzitatorischer Synapsen führt. Im Unterschied zu microisland Kulturen zeigten
konventionelle einschichtige Neuronenkulturen einen Anstieg in der Frequenz
von mIPSCs nach einer drei bis fünf stündigen Behandlung mit löslichem Agrin.
Dieser Effekt war zeit- und konzentrationsabhängig. Allerdings wurden weder
Veränderungen im Verhalten bei der Neurotransmitterausschüttung noch in der
Anzahl von inhibitorischen Synapsen entdeckt. Das Paired-pulse-Verhältnis
blieb unverändert durch die Agrinbehandlung genau wie die Anzahl der
inhibitorischen Synapsen. Die Analyse von agrin-defizienten Neuronen zeigte
keinen Anstieg der mIPSC-Frequenz nach Agrinbehandlung was dafür spricht, dass
endogenes Agrin wichtig für eine exakte Signaltransduktion ist.
Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass microisland Kulturen ein
geeignetes System darstellen, um Synaptogenese mit elektrophysiologischen und
immunocytochemischen Methoden zu untersuchen. In dieser Arbeit konnte mit
diesem Versuchsansatz gezeigt werden, dass Agrin die Bildung oder Stabilität
von Synapsen in kortikalen Neuronen fördern kann, aber nicht essentiell ist
