Invasive bronchopulmonary aspergillosis (IBPA) is a life-threatening disease
in severely immunocompromised patients. Although A. fumigatus is the most
common cause of IBPA, infections with A. terreus are emerging and mortality
rates are comparable to A. Fumigates infections. Although A. terreus is
distributed ubiquitously, the incidence of A. Terreus mediated IBPA is
comparably low. To elucidate the pathogenesis of A. terreus aspergillosis in
comparison to A. Fumigates mediated IBPA, an alternative infection model and
two distinct pulmonary murine infection models were established and
characterised in this study. To induce lethal infections by A. terreus an at
least 100 times higher infectious dose was required than for A. fumigatus, but
even with the highest infectious dose only 50% mortality was observed in
corticosteroidtreated mice. However, surviving mice transiently displayed
clinical symptoms and bioluminescence imaging revealed transient fungal
growth, suggesting that the immune system of surviving animals was able to
control the infection. In moribund animals, the disease pattern largely
resembled A. fumigatus IBPA. However, persistent, ungerminated but viable
conidia were frequently found in alveolar macrophages and pulmonary epithelial
cells of surviving animals. In contrast to A. fumigatus infections, all mice
infected with A. Terreus developed a fatty liver degeneration, possibly due to
the production of toxic secondary metabolites. Thus, at least in mice,
persistence and subclinical liver damage represent unique features of A.
terreus mediated IBPA. Furthermore, these models provide the necessary tools
to investigate the pathogenesis of A. terreus mediated aspergillosis in
detail. The persistence and incomplete germination of conidia in macrophages
and epithelial cells observed in vivo led to the hypothesis that the initial
steps of disease establishment might be fundamentally different between A.
terreus and A. fumigatus. Since alveolar macrophages represent the first
immune cells facing inhaled conidia in the lung, the interaction of A. terreus
and A. fumigatus conidia with these phagocytes was investigated.
Interestingly, A. terreus conidia were phagocytosed more rapidly than A.
fumigatus conidia. This was likely due to the higher exposure of β-1,3-glucan
and galactomannan on the surface of A. Terreus resting and pre-swollen
conidia. In agreement with the increased PAMP exposure observed on conidia,
blocking of dectin-1 and the mannose receptor, the ligand-specific PRRs,
significantly reduced phagocytosis of A. terreus to basal levels, but had only
a moderate effect on phagocytosis of A. fumigatus. While A. fumigatus prevents
phagolysosomal acidification which allows germination within this organelle,
A. terreus conidia persisted in fully matured and acidified phagolysosomes
after phagocytosis. The acidic pH of the phagolysosome prevented germination
of A. terreus conidia, thus resulting in significantly reduced macrophage
cytotoxicity. Blocking phagolysosome acidification by the specific v- ATPase
inhibitor bafilomycin A increased A. terreus germination within phagolysosomes
and consequently cytotoxicity. Thus, it appears that the two fungal species
have evolved different interaction strategies with macrophages: While A.
fumigatus interferes with phagosome maturation and escapes from phagocytes by
germination, A. terreus remains viable but trapped within acidified
phagolysosomes. However, possibly because germlings are more sensitive than
conidia, A. fumigatus is inactivated to a higher extent by macrophages. To
determine factors involved in phagolysosome interaction, this work focused on
pigments which are frequently used for morphological species discrimination in
Aspergillus diagnostics. These pigments are part of the cell wall, provide
defence against physiological stresses and can moreover interact with PRRs of
immune cells. In A. fumigatus, the polyketide synthase PksP produces the
pigment DHN-melanin, which prevents phagolysosome acidification, but is absent
in A. terreus. However, recombinant expression of the A. nidulans wA
naphthopyrone synthase, a homologue of A. fumigatus PksP, in A. terreus
inhibited phagolysosome acidification and resulted in increased germination,
macrophage damage and virulence in corticosteroid-treated mice. In summary,
this study demonstrates for the first time that A. terreus and A. Fumigates
interact fundamentally different with the immune system during disease
establishment. Although aspergillosis caused by A. terreus resembles A.
fumigatus IBPA, significant differences in the interaction with macrophages
suggest a modified pathogenicity strategy. While A. fumigatus hides from
phagocytosis and prevents phagolysosome acidification which allows escape from
macrophages by germination, A._terreus is rapidly phagocytosed, does not
interfere with phagolysosomal maturation but persists within macrophages.
Consequently, the pathogenicity strategy of A. fumigatus cannot be taken as a
general model for all aspergilli but requires species-specific investigation.Die invasive, bronchopulmonale Aspergillose (IBPA) stellt eine
lebensbedrohliche Komplikation in immunsupprimierten Patienten dar.
Hauptverursacher dieses Krankheitsbildes ist A. fumigatus, jedoch nimmt die
Häufigkeit von A. terreus Erkrankungen mit ähnlichen Letalitätsraten zu.
Obwohl A. terreus ubiquitär verbreitet ist, ist die Erkrankungsinzidenz jedoch
verhältnismäßig gering. Um die Pathogenese der A. terreus Aspergillose
vergleichend zu A. fumigatus aufzuklären, entwickelte und charakterisierte die
vorliegende Studie ein alternatives und zwei murine Infektionsmodelle. Um
letale Infektionen in diesen Modellen hervorzurufen, benötigte es einer
mindestens 100fach höheren Infektionsdosis im Vergleich zu A. fumigatus.
Dennoch konnte unter Kortisonbehandlung lediglich eine Mortalität von 50% der
infizierten Versuchstiere beobachtet werden. Lumineszenzmessungen zeigten
jedoch ein transientes Wachstum des Pilzes in überlebenden Tieren, welches mit
klinischer Symptomatik einherging. Dies lässt vermuten, dass eine Kontrolle
der Infektion durch das Immunsystem in diesen Tieren möglich war. Der
Krankheitsverlauf moribunder Tiere glich weitgehend dem einer IBPA durch A.
fumigatus. Allerdings waren in überlebenden Tieren häufig lebende, ungekeimte
Konidien in Alveolarmakrophagen und Epithelzellen der Lunge auffindbar. Im
Unterschied zu einer A. fumigatus IBPA wurde bei allen mit A. terreus
infizierten Tieren, unabhängig vom Infektionsmodell, eine kleinvakuolige,
peripherlobulare, fettige Degeneration der Leber beobachtet. Diese ist
wahrscheinlich auf den Einfluss pilzlicher Sekundarmetabolite zurückzuführen,
die während der Infektion gebildet werden. Somit konnten in dieser Studie, die
Persistenz von Konidien und eine fettige Leberdegeneration als Besonderheiten
der, durch A. terreus verursachten, invasiven Aspergillose identifiziert
werden. Die hier vorliegenden Modelle liefern zudem die Grundlage für die
weitere, detailierte Untersuchung der Pathogenese der A. terreus-induzierten
IBPA. Die, während der Etablierung der in vivo Infektionsmodelle, beobachtete
Persistenz von Sporen in Makrophagen und Epithelzellen führte zu der
Hypothese, dass sich die anfänglichen Prozesse des Infektionsverlaufes
zwischen beiden Pilzspezies grundlegend unterscheiden. Da Alveolarmakrophagen
in der Lunge als professionelle Phagozyten initial mit Pathogenen
interagieren, wurde die Interaktion von Makrophagen mit Sporen von A. terreus
und A. fumigatus untersucht. Sporen von A. terreus wurden wesentlich schneller
und vollständiger phagozytiert als Sporen von A. fumigatus. Dies kann auf eine
erhöhte β- 1,3-Glukan und Galaktomannan Präsentation auf der Oberflache der A.
terreus Sporen zurückgeführt werden. Damit übereinstimmend wurde gezeigt, dass
die Blockierung der, zur Erkennung dieser Zellwandbestandteile notwendigen,
Rezeptoren Dectin-1 und des Mannose-Rezeptors zu einer deutlichen Verringerung
der Phagozytose von A. terreus Sporen durch Makrophagen führte. Die
Phagozytoserate von A. fumigatus wurde durch diese Blockierung nur gering
beeinflusst. Sporen von A. fumigatus verhindern zudem nach der Phagozytose die
Ansäuerung von Phagolysosomen und können durch Auskeimung aus Makrophagen
entkommen, was mit einer Schädigung der Makrophagen einhergeht. Im Gegensatz
dazu persistierten phagozytierte Konidien von A. terreus in angesäuerten
Phagolysosomen ohne auszukeimen und ohne die Makrophagen zu schädigen. Die
Inhibierung der Ansäuerung des Phagolysosoms durch den spezifischen v-ATPase
Inhibitor Bafilomycin A führte zu einer deutlich erhöhten Auskeimungsrate und
Zytotoxizität von A. terreus. Die beiden Aspergillus-Arten scheinen also zwei
unterschiedliche Strategien im Umgang mit Makrophagen entwickelt zu haben:
Während A. fumigatus die Ansäuerung von Phagolysosomen verhindert und durch
Auskeimen entkommt, persistiert A. terreus als Spore in angesäuerten
Phagolysosomen. Dabei wird jedoch ein höherer Anteil von A. fumigatus durch
Makrophagen inaktiviert. Dies liegt vermutlich an der verstärkten
Empfindlichkeit von Keimlingen und Hyphen gegenüber antimikrobiellen Stoffen
im Vergleich zu Sporen. Pigmente als Zellwandbestandteile, haben eine
potentielle Rolle in der Interaktion mit dem Phagolysosom und werden in der
mikrobiologischen Diagnostik häufig als Speziesdiagnostikum verwandt. A.
fumigatus produziert das Pigment DHN-Melanin mit Hilfe der Polyketidsynthase
PksP, welches die Phagolysosomansäuerung verhindert jedoch in A. terreus
fehlt. Durch rekombinante Expression der Naphthopyronsynthase wA von A.
nidulans, einem Homolog der A. fumigatus PksP, in A. terreus konnte die
Ansäuerung des Phagolysosom verhindert werden. Dies führte zu einer erhöhten
Auskeimungsrate in Makrophagen, einer verstärkten Zytotoxizität und erhöhte
die Virulenz im Kortison-Modell. Damit zeigt diese Studie erstmalig, dass A.
terreus und A. fumigatus grundlegende Unterschiede in der Interaktion mit
Phagozyten aufweisen. Trotz gleicher klinischer Symptomatik, entwickelten A.
terreus und A. fumigatus unterschiedliche Pathogenesestrategien, um der
Eliminierung durch das Immunsystem zu entgehen. Während A. fumigatus
Phagozytose sowie Ansäuerung des Phagolysosom verhindert, wird A. terreus
schnell phagozytiert und persistiert in Makrophagen. Folglich kann die IBPA
durch A. fumigatus nicht als Modell für alle Aspergillosen dienen und die
Pathogenese sollte abhängig von der Aspergillus-Art untersucht werden
