Neurofibromatose Typ 1 (NF1) ist eine autosomal dominant vererbte
Multiorganerkrankung, die schätzungsweise bei einem Kind von 2500-3000
Geburten auftritt. Das Krankheitsbild eines NF1 Patienten ist gekennzeichnet
durch Hautveränderungen, den sog. Café-au-lait-Flecken sowie subkutanen und
plexiformen Neurofibromen. Zusätzliche Symptome sind Lisch-Knötchen in den
Augen, mentale Retardierung und Epilepsieanfälle. Spezifische Ver-änderungen
des muskuloskelettale Systems sind Kleinwuchs, Skoliose, Pseudarthrose, Osteo-
porose, tibiale Dysplasie sowie eine verminderte Muskelkraft. Das
krankheitsverursachende NF1 Gen lokalisiert auf Chromosom 17 und kodiert das
kleine GTPase aktivierende Protein Neurofibromin, welches eine Funktion als
Tumorsuppressor ausübt. Vererbte als auch de novo Mutationen im NF1 Gen führen
zu einem nicht-funktionsfähigen Protein, einer Hyperaktivierung des p21 RAS
Proteins und einem dysregulierten Zellteilungsverhalten durch Aktivierung der
RAS/MAPK-Signalkaskade. Das Ziel der Dissertation war die funktionelle
Charakterisierung von Neurofibromin in der Entwicklung des muskuloskelettalen
Systems. Dafür wurde ein konditionelles Knockout Maussystems etabliert, in dem
Nf1 in undifferenzierten mesenchymalen Vorläuferzellen der sich entwickelnden
Extremitäten inaktiviert wurde (Nf1Prx1). Der daraus resultierende Nf1Prx1
Mausphänotyp wurde hinsichtlich seines muskuloskelettalen Phänotyps
charakterisiert. Die Nf1Prx1 Mäuse waren kleiner und die Skelettelemente in
ihrer Größe reduziert. Histolo-gische Untersuchungen, Genexpressionsstudien
und in vivo Analysen belegten, dass in Folge der Aktivierung der RAS/MAPK-
Signaltransduktion die Chondrozytenproliferation verringert war und die
Chondrozytenzonen in der Wachstumsfuge verkürzt vorlagen. Das wohl
auffälligste Merkmal neugeborener Nf1Prx1 Mausmutanten waren die fusionierten
Hüftgelenke, wodurch die Hinterläufe hinterhergezogen wurden und eine normale
Fortbewe-gung verhindert wurde. Dieser Phänotyp entstand in der pränatalen
Entwicklung durch die gestörte Ausbildung eines Gelenkspalts, welcher
normalerweise zwischen den Entwicklungs-stadien E13.5 und E14.5 gebildet wird.
Anhand einer durchgängigen Col2a1 Genexpression und einem persistent nukleär
lokalisiertem SOX9 Protein konnte gezeigt werden, dass die Zellen des
Gelenkspalts weiterhin chondrogenen Charakter besaßen und demnach die Knor-
pelelemente von Pelvis und Femur miteinander verschmolzen blieben. Auch andere
Gelenke wie Ellenbogen- und Kniegelenk waren in der Nf1Prx1 Maus deformiert.
Histologische Analy-sen prä- und postnataler Entwicklungsstadien zeigten, dass
dieser Defekt auf einen zuneh-menden Degradationsprozess in der postnatalen
Entwicklung zurückzuführen ist. Die chondrozytenspezifische Ablation von Nf1
in einem weiteren Mausmodell (Nf1Col2) führte hingegen nicht zu einem
Gelenkphänotyp. Zusätzlich zu den Skelett-Abnormalitäten zeigten Nf1Prx1
Mutanten starke Veränderungen des Muskelapparates. Am Beispiel des M.triceps
konnte demonstriert werden, dass der Muskel kleiner war, die Anzahl an
Muskelfasern pro Muskel reduziert und der Anteil an Fett- und Bindegewebe im
Muskel dramatisch erhöht war. Damit ging eine verringerte Zugkraft der
Vorderextremitäten der Mäuse einher. Um zu prüfen, ob der Muskelphänotyp auf
einen prä-natalen Entwicklungsdefekt zurückzuführen ist, wurden die einzelnen
Phasen der Myogenese näher betrachtet. Immunhistochemische Analysen der frühen
Myogenese demonstrierten, dass weder Migrations- noch Proliferationsprozess
der Muskelvorläuferzellen in den Nf1Prx1 Mausmutanten betroffen waren.
Hingegen konnte anhand der verminderten Genexpressionen von Markern der
Muskeldifferenzierung wie Myogenin und MyoD ein Muskeldifferenzie-rungsdefekt
in der Nf1Prx1 Mutante gezeigt werden. Zudem war die Proliferationsrate der
Myoblasten erhöht und das MYOD Protein vornehmlich nukleär in den
Muskelfibrillen loka-lisiert. Zusammenfassend ist zu konstatieren, dass
Neurofibromin in verschiedenen Aspekten der muskuloskelettelen Entwicklung
eine wichtige Rolle spielt. Die Inaktivierung von Nf1 resul-tiert in einem
Muskel- und Gelenkphänotyp und läßt damit auf einen direkten Zusammenhang in
der Entwicklung der einzelnen Komponenten des muskuloskelettalen Systems
schliessen. Das Nf1Prx1 Mausmodell eignet sich als Modellsystem für die humane
NF1 Erkrankung, da es wichtige Aspekte des humanen muskuloskelettalen NF1
Phänotyps rekapituliert und damit das Entschlüsseln des Pathomechanismus
ermöglicht.Neurofibromatosis Type 1 (NF1) is a tumor predisposition syndrome. It is
inherited in an au-tosomal dominant manner and affects 1 in 2500-3000
individuals. NF1 is mainly characterized by the occurrence of pigmented skin
lesions (café-au-lait spots) and the formation of neurofi-bromas along central
and peripheral nerves. In addition to that, patients suffer from iris Lisch
nodules, mental retardation, learning disabilities and epilepsy. Furthermore,
NF1 patients show musculoskeletal lesions such as short stature, scoliosis,
pseudarthrosis, osteoporosis, tibial dysplasia and a diminished muscle force.
The affected gene Neurofibromin 1 (NF1) is located on Chromosom 17. The
protein negative-ly regulates a key signal transduction protein called p21
RAS. Thus, loss of NF1 activity is expected to lead to the inability to shut
off activated p21 RAS with subsequent aberrant growth promoting signals. In
this work I was able to establish a conditional inactivation approach to
ablate Nf1 function specifically in the early undifferentiated cells of the
developing limbs. Loss of Neurofibromin leads to a severe musculoskeletal
phenotype (Nf1Prx1). Inactivation of Nf1 resulted in short stature and mice
exhibited congenital limb shortening. Measurements of bone growth, histology,
gene expression profiling and in vivo analysis re-vealed diminished
chondrocyte proliferation and a differentiation defect due to the activation
of RAS/MAPK signaling. Newborn Nf1Prx1 mice were easily recognized at birth
due to their inability to bend their hind limbs at the hip joint. Examinations
displayed cartilaginous fusions of the hip joints. This phenotype resulted
from a lack of joint cavity initiation caused by an impaired chondrocyte de-
differentiation in the presumptive joint region. This was shown by a continous
expression pattern of Col2a1, a reduced Gdf5 expression and a nuclear SOX9
localization persisted in all cells of the cartilage anlage in Nf1Prx1 mice.
Elbow and knee joint were severely deformed, too. Histological analysis
indicated a postnatal degradation process of elbow and knee joint. In contrast
to that, chondrocyte specific inactivation of Nf1 did not lead to fused and
mis-shaped joints. Furthermore, loss of Nf1 resulted in a muscle phenotype. In
M. triceps, for ex-ample, muscle size was reduced, number of muscle fibers
diminished but connective tissue and fat was dramatically increased in the
mutant muscle. Nf1Prx1 mice had also diminished grip strength. Detailed
analysis of myogenesis revealed no differences in migration and early
proliferation of muscle precursors in the mutant mice. In contrast, gene
expression of muscle differentiation markers Myogenin and MyoD was reduced.
Besides myoblast proliferation was increased and MYOD protein primarily
localized in the nuclei of Desmin positive muscle fibres. These results
proposed a defect in differentiation of Nf1Prx1 muscles. In fact, Nf1 has
essential multiple roles in skeletal and muscle development and therefore
promotes assumptions on a direct developmental relation of musculoskeletal
components. Nf1Prx1 mouse model recapitulates the human musculoskeletal NF1
phenotype and can be used for understanding pathomechanism and the
establishment of prospective therapy approaches
