Die bisher identifizierten Zielproteine des nukleären Proteasomaktivators
PA28gamma weisen darauf hin, dass dieser an der Regulation wichtiger
zellulärer Prozesse wie der Zellproliferation, der DNA-Reparatur und der
Tumorentstehung beteiligt ist. Es konnte auch gezeigt werden, dass PA28gamma
ein negativer Regulator der Apoptose sein kann, wobei die zugrundeliegenden
Mechanismen noch wenig untersucht sind. Ziel der vorliegenden Arbeit war es
daher, den Einfluss von PA28gamma auf wichtige apoptotische Ereignisse zu
untersuchen. Dafür wurden in vitro-Experimente mit Zelllinien durchgeführt,
bei denen die PA28gamma-Expression durch exogene DNA verstärkt bzw. durch
miRNA-vermittelten Knockdown verringert war. Die Ergebnisse bestätigen
PA28gamma als einen anti-apoptotischen Regulator und zeigen, dass PA28gamma
verschiedene apoptotische Ereignisse beeinflusst. Im Besonderen führt
PA28gamma unter apoptotischen Bedingungen zur Akkumulation von Cytochrom c im
Mitochondrium, zur Inhibierung der Caspaseaktivität, zur Phosphorylierung von
nukleärem p53 und letztendlich zu einer verringerten Apoptose. Die in dieser
Arbeit gewonnen Daten und die daraus resultierenden Hypothesen legen die
Grundlage für weitere detaillierte Untersuchungen der anti-apoptotischen
Funktion von PA28gamma. Verschiedene Tumorarten können mit erhöhten PA28gamma-
Level assoziiert sein. Aber auch bei systemischen Autoimmunerkrankungen
scheint PA28gamma involviert zu sein. Daher sollte ein Sandwich-ELISA zur
Quantifizierung von PA28gamma in humanen Seren entwickelt und anschließend die
Relevanz von PA28gamma als diagnostischer und prognostischer Marker bei diesen
Erkrankungen untersucht werden. Es konnte in allen getesteten Tumor- bzw.
Autoimmunerkrankungen erhöhte PA28gamma-Serumlevel detektiert werden. Der
Vergleich von Patienten mit rheumatoider Arthritis, die mit Abatacept
behandelt wurden, ergab, dass das PA28gamma-Serumlevel signifikant mit dem
Krankheitsaktivitätsindex (DAS28, disease activity score 28) und dem
Entzündungsparameter ESR (Erythrozytensedimentationsrate) korreliert. Die
Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass das PA28gamma-Serumlevel in den
untersuchten Erkrankungen erhöht, aber nicht krankheitsspezifisch ist. Bei
Patienten mit rheumatoider Arthritis kann PA28gamma als neuer zusätzlicher
Marker für den Verlauf der Erkrankung bzw. für die Untersuchung des
Therapieverlaufs eingesetzt werden, da das PA28gamma-Serumlevel mit den
spezifischen Markern für diese Erkrankung korreliert. Die Kenntnis über die
genaue Bindungsstelle eines Autoantikörpers an ein Autoantigen ist für das
Verständnis von Autoimmunerkrankungen und zur Entwicklung von Antikörper-
basierten Assays bzw. Therapien von großem Nutzen. Daher sollte u.a. mit Hilfe
des für den Sandwich-ELISA hergestellten PA28gamma-Hyperimmunserums validiert
werden, ob ein Microbead-basierter Multiplex-Immunoassay zum Epitopmapping von
Antikörpern eingesetzt werden kann. Dabei wurden Streptavidin-beschichtete,
Fluoreszenz- und Größen-codierte Microbeads mit überlappenden, biotinylierten
Peptiden des Antigens beladen und mit dem zu testenden Serum inkubiert. Der
Multiplex-Immunoassay identifizierte die gleichen Peptide wie ein
entsprechender ELISA. Mit dem erfolgreich validierten Microbead-basierten
Multiplex-Immunoassay ist es gelungen ein kostengünstiges und zeitsparendes
Verfahren zum Epitopmapping von Antikörpern zu etablieren.Proteasome activator PA28gamma is an important regulator of many cellular
processes among them proliferation, DNA damage response and tumor development.
Different studies demonstrated that PA28gamma is also involved in apoptosis
but the underlying mechanism has not been investigated yet in detail. The aim
of the study was to study the impact of PA28gamma on characteristic apoptotic
events. Therefore, we employed cell lines with gain of function and miRNA-
mediated gene silencing. It has been demonstrated that PA28gamma affects
characteristic apoptotic events in vitro. In detail, under apoptotic
conditions PA28gamma leads to an accumulation of mitochondrial cytochrome c,
to an inhibition of caspase activity, to an enhanced phosphorylation of
nuclear p53, and consequently to a reduction of apoptosis. The results of this
study and the resulting hypothesis provide the basis for further
investigations of the anti-apoptotic role of PA28gamma. Different tumors are
associated with enhanced PA28gamma expression. Furthermore, PA28gamma is also
involved in systemic autoimmune diseases. Therefore, the aim of this study was
to develop a PA28gamma-specific sandwich ELISA for the quantification of
PA28gamma in human sera. In addition, it was intended to use this ELISA to
investigate the relevance of PA28gamma as a diagnostic and prognostic marker
in different tumor and autoimmune diseases. The developed sandwich ELISA was
able to detect enhanced levels of PA28gamma in all investigated sera of tumor
and autoimmune diseases. Comparison of patients with rheumatoid arthritis,
which were treated with abatacept, showed that PA28gamma sera level
significantly correlates with the disease activity score 28 (DAS28) and the
inflammation parameter ESR (erythrocyte sedimentation rate). The results
obtained in this study reveal that PA28gamma is elevated in the sera of
patients with tumor or autoimmune diseases but, unfortunately, this is not
diseases specific. However, PA28gamma correlates with different markers of
rheumatoid arthritis and could be a new additional marker for the
investigation of progression and treatment of this disease. To understand
autoimmune diseases and to develop appropriate assays and immune therapies,
the knowledge of the antibody binding site is important. The aim of this study
was to validate if a microbead-based multiplex immunoassay can be used for
epitope mapping of antibodies. Therefore, recombinant synthesized overlapping
peptides were coupled via biotin with streptavidin-coated, fluorescence- and
size-encoded microbeads and incubated with the sera. The multiplex immunoassay
was able to detect the same peptides as a corresponding sandwich ELISA. The
results of this study reveal a fast and inexpensive method for epitope mapping
of antibodies
