0\. Titelblatt, Inhaltsverzeichnis
1\. Einleitung 1
1.1 Nano- und Mikropartikuläre Arzneistoffträgersysteme 1
1.2 Feste Lipidnanopartikel 2
1.3 Ziele der Dissertation 3
2\. Material und Methoden 4
2.1 Methoden 4
2.2 Materialien 20
3\. SLN als Impstoffadjuvantien 30
3.1 Einleitung 30
3.2 SLN als Adjuvans für die Vakzinierung von Hennen 37
3.3 Untersuchungen zum Einfluß der Adjuvansmenge und Partikelgröße auf die
Immunantwort am Huhnmodell 46
3.4 Ausblick 65
4\. SLN als Gentransfervehikel 66
4.1 Einleitung 66
4.2 Formulierungsentwicklung und -optimierung I 75
4.3 Formulierungsentwicklung und -optimierung II 119
4.4 Vergleich mit Liposomen 153
4.5 Weitergehende physikalische Charakterisierung 159
4.6 Steigerung der Transfektionseffiziens durch den Einsatz von
Kernlokalisationssequenzen (NLS) 166
5\. Zusammenfassung 172
6\. Literaturverzeichnis 175
7\. Anhang 191
7.1 Verwendete Abkürzungen 191
7.2 Liefernachweise der Geräte und Materialien 194
7.3 Verwendete Puffersubstanzen und Lösungen 198
7.4 Publikationen und Kongreßbeiträge 200
7.5 Danksagung 202
7.6 Lebenslauf 203Der erste Teil der Arbeit handelt von Untersuchungen zum Einsatz von Festen
Lipid Nanopartikeln (engl. Solid Lipid Nanoparticles, SLN) als
Impfstoffadjuvatien. Zu diesem Zweck wur-den Hennen unter Zusatz von SLN
immunisiert und der IgY-Antikörpertiter in den Eidottern bestimmt. Der Vorteil
dieses Verfahrens lag in der unblutigen Probennahme. Der adjuvante Effekt
wurde mit Freunds kompletten bzw. inkompletten Adjuvans (FCA/FIA) und mit der
Vakzine ohne Adjuvans verglichen. Dabei zeigte sich, daß es durch den Zusatz
von SLN zu der Vakzine zu einer charakteristischen Veränderung des zeitlichen
Verlaufs der Antikörpertiterbildung kam. Dies ist ein Zeichen für eine
adjuvante Wirkung. Die Gewebeverträglichkeit der SLN war sehr gut. Allerdings
war die Steigerung der Antikörpertiter nur gering. Weitere Versuche sollten
sich deshalb auf die Optimierung des Vakzinationsprotokolls und eventuell auf
den Einsatz anderer Antigene konzentrieren. Der zweite Teil der Dissertation
handelt von der Entwicklung eines SLN-Systems zur Transfektion. Basierend auf
ersten Versuchen wurde am Modell der in-vitro-Transfektion von Cos-1 Zellen
eine Formulierungsoptimierung durchgeführt, die zu einer sehr effizienten
Formulierung mit guter Verträglichkeit geführt hat. Die Zytotoxizität wurde
vom eingesetzten kationischen Lipid bestimmt. Einkettige kationische Lipide
zeigten eine hohe Zytotoxizität, während zweikettige gut verträglich waren.
Für die Transfektionseffizienz wurde eine Abhängigkeit sowohl vom kationischen
Lipid als auch vom eingesetzten Matrixlipid gefunden. Die kationischen SLN
waren sehr gut lagerstabil und ließen sich problemlos autoklavieren. Mit
kationischen SLN konnten vergleichbar gute Transfektionseffizienzen wie mit
Liposomen erzielt werden. Durch die Kombination mit der
Kernlokalisationssequenz TAT2 konnte die Transfektionseffizienz zusätzlich
noch um zwei Zehnerpotenzen gesteigert werden.The first part is dealing with investigations concerning the application of
Solid Lipid Nano-particles (SLN) as a vaccine adjuvant. For this purpose we
vaccinated hens under addition of SLN and determined the egg yolk
concentrations of IgY. The advantage of this technique is the bloodless sample
preparation. The adjuvant effect was compared to freund's complete/incomplete
adjuvant (FCA/FIA) and to the vaccine without any adjuvant. The SLN induced
characteristic changes of the chronological titer development. This is an
indication of an adjuvant effect. The tissue tolerability was very good.
Antibody titers were enhanced only slightly. Further experiments should be
performed to optimise the vaccination protocol and to investigate the effect
of different antigenes. The second part is about the development of cationic
SLN as a new transfection agent. Based on first experiments the formulation
was optimised. For this purpose an in vitro transfection model based on Cos-1
cells was employed. The optimisation lead to a very efficient formulation with
good tolerability. The cationic lipids employed determined cytotoxicity: one-
tailed cationic lipids showed high cytotoxicity, while two-tailed cationic
lipids were well tolerated. Transfection efficiency was dependent on the
cationic lipid and the matrix lipid used. Cationic SLN showed very good
storage stability. Steam sterilization was possible. SLN and cationic
liposomes revealed comparable transfection efficiencies. Combination of
cationic SLN with the nuclear localisation signal TAT2 increased transfection
efficiency hundredfold
