Kryokonservierung von humanen vaskulären Nabelschnurzellen unter Bedingungen
angepasst an die Regularien der "Guten Herstellungspraxis" für künftige
Zellbanken
Introduction: Cardiovascular disease is the leading cause of death and
disability worldwide and estimated 23.6 million people will die from the
disease in 2030. In vitro fabricated tissue engineered vascular constructs
could provide an alternative to conventional substitutes such as mechanical
and biological grafts which are currently satisfactorily used as implants in
cardiac surgery. Vascular cells from the human umbilical cord represent an
appropriate cell source because they are similar to the native cellular
structures and functionalities found in heart valves and they can be directly
isolated and cryopreserved until needed. Use of these cells for therapeutic
applications such as tissue engineered cardiovascular constructs requires the
establishment of a human vascular cell bank conforming to Good Manufacturing
Practice (GMP) conditions. Methodology: The replacement of conventional
research and development starting materials by GMP compliant starting
materials was a crucial step during isolation, cultivation and
cryopreservation process of human umbilical cord artery derived cells (HUCAC)
and human umbilical vein endothelial cells (HUVEC). To analyse the influence
of cryopreservation, the cells were short and long term cyropreserved directly
after primary culture, and recultivated subsequently. Fresh and cryopreserved
cells were studied concerning cell viability, expression of cellular markers
and proliferation potential using trypan blue staining, flow cytometry
analysis, immunofluorescence staining and proliferation assays. Results: Cell
isolation was successful using GMP compliant starting materials since
sufficient numbers of cells with acceptable viabilities and homogenous
expression of cellular markers were obtained. Cryopreserved cells mostly
maintain phenotypic and functional characteristics similarly to fresh cells,
confirming that the influence of cryopreservation was negligible.
Consequently, fresh cultivated and cryopreserved HUCAC expressed alpha smooth
muscle actin, CD90, CD105, CD73, CD29, CD44, CD166 but not smoothelin, and
HUVEC were positive for CD31, CD146, CD105 and CD144 but negative for alpha
smooth muscle actin. Acceptable viability and sufficient proliferation
properties of cryopreserved HUCAC and HUVEC were analysed in functional
studies. Conclusion: Cell isolation, cultivation and cryopreservation were
successfully adapted to GMP compliant starting materials. The influence of
cryopreservation to cell properties was marginal and without lasting effect
confirming that vascular cells from the human umbilical cord represent a
potential cell source for cell banking. Using flow cytometry analysis a
specific cellular marker expression profile was developed for HUCAC and HUVEC,
usable as a GMP compliant quality control. For the future fabrication of
advanced therapy medicinal products consisting of these cells, GMP conditions
are required by the regulatory authority.Einleitung: Kardiovaskuläre Erkrankungen stellen weltweit die häufigste
Ursache für Todesfälle und Behinderungen dar. Bis 2030 werden voraussichtlich
23,6 Millionen Menschen an diesen Erkrankungen sterben. Die in vitro
Herstellung von kardiovaskulären Substituten mittels Tissue Engineering (TE)
könnte eine mögliche Alternative zu den derzeit etablierten mechanischen und
biologischen Ersatzprothesen für Gefäße und Herzklappen bieten. Vaskuläre
Zellen der humanen Nabelschnur könnten sich für das TE als Zellquelle eignen,
da diese den nativen Zellen der Herzklappe in Struktur und Funktionalität
ähneln. Sie können direkt isoliert und als individuelle bzw. allogene
Zellquelle kryokonserviert werden. Die Verwendung dieser Zellen für
therapeutische Zwecke, wie zum Beispiel das TE kardiovaskulärer Substitute,
erfordert die Entwicklung einer humanen vaskulären Zellbank, die an die
Bedingungen der Good Manufacturing Practice (GMP) angepasst ist. Methodik:
Einen wesentlichen Meilenstein stellte eine konsequente Adaption der gängigen
Forschungs- und Entwicklungs- Reagenzien an pharmazeutisch einsetzbare, GMP
konforme Ausgangsstoffe während der Isolierung, Kultivierung und
Kryokonservierung von human umbilical cord artery derived cells (HUCAC) und
human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) dar. Um den Einfluss der
Kryokonservierung auf die Zellen zu untersuchen, wurden diese direkt nach der
Primärkultur kurzzeit- und langzeitkryokonserviert und anschließend
rekultiviert. Zellvitalität, Expression zellulärer Marker und
Proliferationspotential frisch kultivierter und kryokonservierter Zellen
wurden unter Anwendung der Trypanblau-Färbung, Durchflusszytometrie,
Immunfluoreszenzfärbung und des Proliferationsassay untersucht. Ergebnisse:
Unter Verwendung von GMP konformen Ausgangsstoffen wurde eine zufrieden
stellende Anzahl von Zellen aus den Gefäßwänden der Nabelschnur isoliert und
die Zellen wiesen eine akzeptable Vitalität sowie eine homogene Expression
zellulärer Marker auf. Der Einfluss der Kryokonservierung auf die Zellen
erwies sich als geringfügig denn die phänotypischen und funktionellen
Eigenschaften waren weitgehend mit denen frisch kultivierter Zellen
vergleichbar. Frisch kultivierte und kryokonservierte HUCAC exprimierten alpha
smooth muscle actin (ASMA), CD90, CD105, CD73, CD29, CD44, CD166, jedoch nicht
smoothelin. HUVEC zeigten positive Signale für CD31, CD146, CD105 und CD144,
ASMA konnte hingegen nicht detektiert werden. In funktionellen Analysen
konnten eine akzeptable Vitalität und ein zufrieden stellendes
Wachstumsverhalten der HUCAC und HUVEC ermittelt werden. Schlussfolgerung: Die
Zellisolierung, Kultivierung und Kryokonservierung wurde erfolgreich an GMP
konforme Ausgangsstoffe angepasst. Die Kryokonservierung beeinflusste die
Eigenschaften der Zellen nur geringfügig und ohne nachhaltige Auswirkungen,
weshalb die Verwendung dieser vaskulären Nabelschnurzellen für eine Zellbank
durchaus möglich ist. Ein zellspezifisches Markerprofil wurde für die HUCAC
und HUVEC mit Hilfe der Duchflusszytometrie etabliert, welches als GMP
konforme Qualitätskontrolle einsetzbar wäre. Für die zukünftige Herstellung
von Medizinprodukten aus diesen Zellen wird von den Kontrollbehörden eine GMP-
Konformität für alle Herstellungsstufen gefordert
