Titelblatt und Inhaltsverzeichnis
Einleitung
Material und Methoden
Ergebnisse
Diskussion
Abbildungsverzeichnis
Literaturverzeichnis
Danksagung
Lebenslauf
ErklärungWährend der Entwicklung haben die Nervenzellen des Gehirns die bemerkenswerte
Fähigkeit, gegenseitige Verbindungen auszubilden, ein Entwicklungsvorgang, der
präzises axonales Auswachsen, Wegfindung und korrekte Synapsenbildung
voraussetzt. Im Gegensatz dazu, ist die Fähigkeit, neuronale Kontakte nach
Läsion wieder herzustellen im ZNS sehr begrenzt. Zunächst untersuchten wir in
vitro die späte embryonale und postnatale Entwicklung der hippocampalen
Formation mit ihren Projektionen, in für das Homeobox-Gen Emx2-defizienten
Mäusen. Da die Emx2-Knockout-Tiere perinatal versterben, haben wir
organotypische Schnittkulturen hergestellt. In Schnitten von Knockout-Tieren
war die Zytoarchitektur des prospektiven Gyrus dentatus gestört, reiften die
Körnerzellen nicht aus und bildeten auch keinen Moosfasertrakt. Diese Befunde
zeigen, dass Emx2 essentiell für die endgültige Differenzierung der
Körnerzellen und ihrer korrekten Ausbildung der intrinsischen hippocampalen
Projektionen ist. Im nächsten Versuchsaufbau konnten wir unter Verwendung der
organotypischen Kokultur und anhand von in vivo Experimenten weiterhin in
unseren Untersuchungen belegen, dass in den Vorgängen des Auswachsens, der
Wegfindung und der synaptischen Zielfindung während der Entwicklung und nach
Läsion, die Entität der Polysialinsäure (Polysialic Acid = PSA) involviert
ist. Diese stellt eine einzigartige während der Entwicklung regulierte
posttranslationale Modifikation des Neuralen Zelladhäsionsmolekül (Neural Cell
Adhesion Molecule) NCAM dar. Durch die Verwendung eines chemisch veränderten
Sialinsäurevorläufers, konnten wir die Polysialylierung von NCAM zu
definierten Entwicklungs- und postläsionalen Zeitpunkten hemmen. Der PSA-
Mangel bewirkte nicht nur eine fehlerhafte Moosfaserverteilung in der CA3-
Pyramidenzellband, sondern auch das aberrante Eindringen von Moosfasern in die
CA1-Region in vivo und förderte das axonalen Auswachsens in vitro. Des
Weiteren war die Reinnervation der Moosfasern nach Läsion durch die Inhibition
der PSA-Synthese in vitro signifikant erhöht. Basierend auf diesen Ergebnissen
schlussfolgern wir, dass PSA notwendig für die axonale Zielfindung während der
Ausbildung neuraler Schaltkreise ist und andererseits die Regeneration nach
Läsion stört. Dieses Fazit impliziert umgekehrt einen positiven Effekt der
pharmakologischen Modifikation von NCAM auf die Regeneration nach axonaler
Schädigung, die sich in weiterführenden Experimenten als viel versprechend, in
Hinblick auf einen möglichen therapeutischen Nutzen, herausstellen könnte. Um
das Phänomen des axonalen Auswachsens besser untersuchen zu können, variierten
wir das bereits etablierte Modell der organotypischen Kokultur. In dieser
Arbeit nutzten wir die Axonales Auswachsen in der Hippocampusformation 58
organotypische Kokultur mit neugeborener wildtyp und β-Aktin-GFP transgener
Maus. Dies erlaubte es uns, die Axone in situ zu markieren und die gesamte
Projektion zu verfolgen. In Kokulturen von entorhinalem Cortex und Hippocampus
terminierten die GFP-markierten entorhinalen Axone und die kommissuralen Axone
in den korrekten hippocampalen Schichten. Ausgehend von diesen Befunden,
konnten wir demonstrieren, dass dieser Chimären-Kokultur- Ansatz dazu geeignet
ist, die Gesamtheit sich entwickelnder Projektionen darzustellen und die
Möglichkeit bietet, direkt das axonale Ansteuern und Auswachsen lebender
Neuronen zu beobachten.During development, nerve cells within the brain have the remarkable ability
to form mutual interconnections, a process that relies on precisely
orchestrated steps of axonal outgrowth, pathfinding, and correct synaptic
targeting. In contrast, reestablishing neuronal circuits after lesion in the
CNS is extremely limited. First we analysed the late embryonic and postnatal
development of the hippocampal formation and its axonal projections in mice
lacking the homeobox gene Emx2 expression in vitro. Since the Emx2 mutants die
perinatally we used slice cultures of Emx2 mutant hippocampus to circumvent
this problem. In mutant cultured hippocampus the presumptive dentate gyrus
failed to develop its normal cytoarchitecture and mature dentate granule
cells, including the lack of their mossy fiber projection. These data indicate
that Emx2 is essential for the terminal differentiation of granule cells and
the correct formation of intrinsic hippocampal connections. In another set-up,
using the model of the organotypic slice culture as well as in vivo
experiments in our investigations we were able to provide confirmation, that
the processes of outgrowth, pathfinding, and synaptic targeting during
development and following lesion involve the polysialic acid (PSA) moiety,
which is a unique, developmentally regulated posttranslational modification of
the neural cell adhesion molecule (NCAM). Using a chemically modified sialic
acid precursor, we inhibited NCAM polysialylation at selected developmental
and postlesional time points. PSA deficiency resulted not only in an abnormal
mossy fiber pattern in the CA3 pyramidal layer but also in aberrant invasion
of mossy fibers into the CA1 region in vivo and promotion of axonal outgrowth
in vitro. Furthermore, the reinnervation by mossy fibers after lesion was
significantly enhanced when inhibiting PSA formation in vitro. Based on our
data, we conclude that PSA is necessary for correct axonal targeting during
neuronal circuit formation, but inhibits regeneration after lesion.
Conversely, these results imply that pharmacological modification of NCAM
could be beneficial for regeneration following axonal damage, and further
experiments may be promising with regard to a potential therapeutical use of
this approach. And finally to better investigate the phenomenon of axonal
outgrowth, we modified the wellestablished organotypic slice culture approach.
Here we used organotypic slice co-cultures from neonate wild-type mice and ß
-actin-gfp transgenic mice, which allowed us to prelabel the vital axons and
to monitor the complete axonal projection. In co-cultures from entorhinal
cortex and hippocampus, gfp-labeled entorhinal axons and commissural
projections terminate in their correct hippocampal layers. From our data, we
demonstrate that this chimaeric co-culture Axonales Auswachsen in der
Hippocampusformation 60 approach is appropriate in tracing entire developing
projections and may serve as a tool in directly observing the navigation and
axonal elongation of living neurons
