Proteasome sind zelluläre Proteasen, involviert in den Abbau von einer
Vielzahl zellulärer Proteine. Das 20S Proteasom ist ein zylindrischer 28-mer
Protein-Komplex, welcher aus zwei außenständigen sieben-Ringen (α-Ringe;
Substrateingang) und zwei innenliegenden sieben-Ringen (β-Ringe; katalytisches
Zentrum) besteht. Zahlreiche Studien haben den Beweis erbracht, dass das 20S
Proteasom Peptide in verschiedenen Längen sowie komplette denaturierte
Polypeptidketten abbaut. Jedoch konnte bis jetzt nicht der Beweis erbracht
werden, dass das 20S Proteasom fähig ist, ein oberflächengebundenes,
immobilisiertes Peptid zu prozessieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine
Methode entwickelt, die erstmalig den proteasomalen Verdau trägerfixierter
Peptide über den massenspektrometrischen Nachweis in Lösung gegangener
Peptidfragmente charakterisiert. Initial wurden unterschiedliche Träger (Gold,
Silizium und glass-beads) getestet und neuartige Funktionalisierungsmethoden
für eine optimale Peptidanbindung etabliert. Hierbei wurde jede
Funktionalisierungsstufe mittels verschiedener optischer und elektrochemischer
Verfahren charakterisiert. Schließlich wurde der proteolytische Verdau der
kovalent fixierten Peptide mittels LC-MS/MS analysiert und kartographiert.
Während der Methodenentwicklung zeigte sich, dass die glass-beads aufgrund der
signifikant geringer einzusetzenden Peptidmenge und der resultierenden
absoluten Peptidstoffmenge am besten geeignet sind. Mit diesem optimierten
Versuchsaufbau konnte erstmalig das Abbauverhalten verschiedener fixierter
Peptide durch das Proteasom mittels nanoLC-MS/MS nachgewiesen werden. Zum
ersten Mal konnte gezeigt werden, dass das Proteasom N-Terminal fixierte
Substrate mit einer erheblich beschleunigten Abbaurate prozessieren kann im
Vergleich zum gelösten Substrat. Des Weiteren konnte ein verändertes
Schnittmuster im Vergleich zum gelösten Substrat beobachtet werden, das jedoch
teilweise mit dem bekannten, in Lösung verdauten Substrats, übereinstimmt.
Zusammenfassend weisen die Ergebnisse darauf hin, dass auch die in den
Lösungsraum orientierten Termini membranständiger Proteine ubiquitin-
unabhängig durch das 20S Proteasom degradiert werden könnten. Die von uns
etablierte Methode legt außerdem den Grundstein für die Entwicklung von semi-
automatischen Verfahren für die schnelle Identifizierung von Abbauprodukten
oder anderen enzymatischen Prozessen.Proteasomes are cellular proteases involved in the degradation of numerous
cellular proteins. The 20S proteasome is a cylindrical 28-mer protein complex
composed of two outer heptameric α-rings forming the entrance for the protein
substrate and two inner heptameric β-rings carrying the catalytic sites.
Numerous in vitro studies have provided evidence that the 20S proteasome may
degrade peptides of various lengths and even unfolded full-length polypeptide
chains. However, a direct demonstration that the 20S proteasome may also
cleave surface-attached immobilized peptides is lacking so far. In the present
work a method was developed which characterized the proteasomale digestion of
solid-phase bound peptides by peptide fragments in the aqueous phase.
Initially different surfaces (gold, silicon and glass-beads) were selected and
novel functionalization methods for an optimal peptide fixation were
established. During this procedure, every functionalization step was
characterized by different optical and electrochemistry techniques. Finally,
the protolytical fragments of the proteasome digestion of the covalent fixed
peptides were analyzed by LC-MS/MS and map. Based on the preliminary results
glass-beads showed to be the eligible candidate for the further experiments
due to the significant fewer amounts of peptides required for the surface
fixation and yield of coupled peptides. With this optimized setup we were for
the first time able to demonstrate by means of nanoLC-MS/MS the proteasomal
digestion of different surface fixed peptides. Our results clearly
demonstrated that the proteasome is able to degrade N-terminal fixed peptides
with a much higher degradation rate as compared to the soluble substrate.
Furthermore, a modified cleavage pattern could be observed between surface-
fixed or in solution proteasomale digestion. However, some digestion products
are detectable in both approaches. In summary, this finding supports our
initial hypothesis that proteasomes may be able to directly degrade segments
of membranebound proteins protruding into the aqueous phase. Furthermore, this
study lays the foundation for the development of semi-automatic methods to
identify very rapidly proteasomale digestion products
