Diese Publikationspromotion umfasst drei in internationalen Fachzeitschriften
publizierte Artikel, die sich mit der Isolation und Charakterisierung von
primären humanen parenchymalen und nicht-parenchymalen Leberzellen (NPC) sowie
deren Anwendung in in vitro Lebermodellen beschäftigen. Die klassische
2-dimensionale (2D) Kultur primärer humaner Hepatozyten (PHH) bildet den
Goldstandard für die Untersuchung der in vitro Hepatotoxizität. Allerdings
fehlt in diesen Kulturen die Anwesenheit NPC. Die NPC, zu denen Kupffer Zellen
(KC), Leberendothelzellen (LEC) und hepatischen Stellat-Zellen (HSC) zählen,
spielen eine zentrale Rolle bei physiologischen und pathophysiologischen
Prozessen. Im Rahmen der Medikamenten-induzierten Leberschädigung (engl. Drug
induced liver injury - DILI) kann es durch immunmodulierende Reaktionen von
NPC sowohl zu einer vermehrten Schädigung des Lebergewebes, aber auch zur
Induktion von immunologischer Toleranz kommen. Durch die Entwicklung
innovativer Kokulturmodelle könnte die möglicherweise die immunologische
Modulation von Hepatotoxiziät erfasst werden. Im Rahme dieser
Publikationspromotion wurde eine Methode etabliert, um PHH und NPC aus
demselben Lebergewebe zu isolieren. Nach erfolgreicher Identifizierung und
Charakterisierung bildeten diese die Grundlage für die Etablierung eines in
vitro Lebermodels zur Untersuchung immunologischer Reaktionen im Rahmen von
DILI. PHH und NPC wurden mit Hilfe einer zweistufigen EDTA/Kollagenase-
Perfusionstechnik aus einem Stück humanem Lebergewebe isoliert. Die in der
NPC-Fraktion enthaltenen KC, LEC und HSC wurden mittels Adhärenz-Trennung und
magnetischer Zellsortierung voneinander getrennt. Nach Identifikation der NPC
mittels spezifischer Antikörper und immunfluoreszenz Mikroskopie konnten
Ausbeuten von 1,9x106 KC, 2,7x105 LEC und 4,7x105 HSC pro g Lebergewebe mit
Viabilitäten > 90% und Reinheiten > 90% verzeichnet werden. Die anschließende
Charakterisierung funktioneller Parameter in Kultur über 5 Tage zeigte, dass
KC über eine limitierte Lebenszeit verfügen, LEC sich aus einer heterogenen
Mischpopulation zusammensetzen und HSC zur Transdifferenzierung in
Myofibroblasten neigen. Um DILI zu simulieren wurden KC mit den Überständen
von substanzbehandelten PHH stimuliert. Die KC Aktivierung wurde durch Messung
der reaktiven Sauerstoffspezies (ROS, DCF-Assay) und der Zellaktivität (XTT-
Test) sowie deren immunologische Reaktion mit Hilfe von verschiedenen Zytokin-
ELISA evaluiert. In den KC konnte sowohl ein Anstieg der Zellaktivität, als
auch eine donor-spezifische ROS-Bildung beobachtet werden. Zusätzlich zeigte
sich eine donor- und medikamentenabhängige Ausschüttung von pro- und anti-
inflammatorischen Zytokinen. Das beschriebene Isolationsprotokoll ermöglicht
eine simultane Isolation von PHH und NPC in guter Qualität und Quantität aus
einem Stück Lebergewebe. Die Charakterisierung zeigte, dass sich KC am besten
für den Einsatz in einem Lebermodell eignen. Die Detektion sowohl donor- als
auch medikamentenspezifischer immunologischer Reaktionen macht das etablierte
Modell zu einem vielversprechenden Ansatz für die Untersuchung der
Medikamenten induzierten Hepatotoxizität.This thesis comprises three peer reviewed publications dealing with the
isolation, and characterization of primary human parenchymal and non-
parenchymal liver cells (NPC) and their application in in vitro liver models.
2 dimensional monocultures of primary human hepatocytes (PHH) are considered
to be the gold standard for in vitro testing of hepatotoxicity. However, these
models miss the presence of NPC. NPC consist of Kupffer cells (KC), liver
endothelial cells (LEC), and hepatic stellate-cells (HSC) and play a central
role in physiological and pathophysiological processes. Regarding drug-induced
liver injury (DILI), NPC can modulate immunologic reactions leading to an
augmented damage of the liver tissue but also to induction of immunologic
tolerance. The development of innovative co-culture models could possibly help
to understand the immunologic modulation of hepatotoxicity. This thesis
outlines the establishment of a method to isolate PHH and NPC from the same
liver tissue specimen. The successful identification and characterization
paved the way for the establishment of an in vitro liver model for the
investigation of immunologic reactions caused by DILI. PHH and NPC were
isolated from human tissue samples using a two-step EDTA/collagenase perfusion
technique. KC, LEC, and HSC were separated using specific adherence properties
and magnetic activated cell sorting. The NPC were identified using specific
antibodies and immunofluorescent microscopy. The quantifications revealed a
yield of 1.9x106 KC, 2.7x105 LEC and 4.7x105 HSC per gram liver tissue,
showing viabilities >90% and purities >90%. Subsequently, the characterization
of functional parameters during a culture time of 5 days showed that KC
dispose a limited life span, LEC consist of a heterogeneous population and HSC
tend to transdifferentiate in myofibroblasts. For the simulation of DILI, KC
were stimulated with supernatants from drug treated PHH. KC activation was
investigated by the measurement of reactive oxygen species (ROS, DCF-assay)
and cell activity (XTT-assay) and the immunologic reactions by analysis of
cytokine production (ELISA). In KC an increase of cell activity as well as a
donor specific ROS-formation was observable. Additionally, donor and drug
dependent releases of pro- and anti-inflammatory cytokines were detected. The
isolation protocol described, enables the isolation of PHH and NPC in high
quality and quantity from one piece of liver tissue. The characterization
showed that KC were the most suitable cell type for usage in in vitro models.
The detection of donor- as well as drug specific immunologic reactions makes
the established model to a promising tool for the investigation of DILI
