Ziel der vorliegenden Arbeit war es die molekularen Mechanismen der
neuroprotektiven Wirkung der Hexokinase II in einem in vitro Modell der
zerebralen Ischämie zu untersuchen. Klassischerweise gehört die Hexokinase II
(HKII) zu den vier Hexokinase Isoenzymen, die den ersten obligatorischen
Schritt im Glukosestoffwechsel von Säugetieren katalysieren. Neben ihrer
zentralen Rolle im Energiemetabolismus kommt der HKII eine funktionelle
Bedeutung innerhalb der Apoptoseregulation zu. Zur Charakterisierung der
neuroprotektiven Eigenschaften der HKII wurden Expressionsvektoren mit
Punktmutationen in bereits bekannte, funktionell und strukturell wichtige HKII
Domänen generiert, in eine primäre Neuronenkultur transfiziert und im Rahmen
der kombinierten Sauerstoff- und Glukose-Deprivation (OGD) beziehungsweise
reinen Sauerstoff-Deprivation (OD) oder Glukose-Deprivation (GD) auf ihre
antiapoptotischen Effekte getestet. Die Ergebnisse demonstrieren die
essentielle Bedeutung der mitochondrialen HKII-Bindung für die Vermittlung des
neuronalen Zellschutzes im OGD-Modell, dargestellt durch die Aufhebung der
protektiven Effekte bei Überexpression einer mitochondrialen
Lokalisationssequenz defizienten HKII Mutante. Durch funktionelle Testung
einer Akt-Phosphorylierungsdefizienten HKII Mutante und Akt-Phosphomimetischen
HKII Mutante konnte eine apoptose-regulatorische Wirkung des HKII-Akt-
Phosphorylierungsmotifs unter hypoxischen Bedingungen nachgewiesen werden. Der
negative Effekt der HKII-BH-4 Domäne inaktivierten Mutante auf das
Neuronenüberleben bestätigt die Funktionalität einer im C-Terminus des HKII
Proteins postulierten HKII-BH-4 Domäne. In Zellkulturexperimenten mit einer
katalytisch-inaktiven HKII Doppelmutante zeigte sich eine Glukoseabhängigkeit
der antiapoptotischen Eigenschaften der HKII. Die katalytische Aktivität der
HKII ist maßgeblich an der zellschützenden Wirkung des glykolytischen Enzyms
beteiligt und macht die HKII zu einem interessanten Verknüpfungspunkt zwischen
Zellmetabolismus und Apoptoseregulation. Durch die strukturell-funktionelle
Charakterisierung der HKII-vermittelten Neuroprotektion erschließt sich ein
besseres Verständnis der ablaufenden molekularen Mechanismen innerhalb der
Apoptoseregulation. Diese Erkenntnisse bieten einen gezielteren Ansatz für die
Identifizierung und Entwicklung von neuen Wirkstofftargets zur Therapie von
neurodegenerativen- und Tumorerkrankungen. Da die HK neben ihrer ubiquitären
Expression eine allgemein große Bedeutung für den Glukosemetabolismus in
Säugetierzellen hat, könnten die nachgewiesenen funktionell- wichtigen HKII
Domänen auch über neuronale Zellen hinaus relevant sein und beispielsweise zur
Therapieoptimierung bei einem Myokardinfarkt beitragen.Hexokinase II (HKII) is one of 4 mammalian Hexokinase isoenzymes catalyzing
the first obligatory step of glucose metabolism. In addition to their
catalytical activity, HKII is also believed to play a role in regulating cell
death. In the state of ischemic tolerance Hexokinase II is upregulated by
Hypoxia inducible factor 1 (HIF-1). In order to investigate the role of HKII
in neuroprotective signaling, site directed mutagenesis was used to generate
several murine HKII expression vectors with mutations in domains relevant for
glucose metabolism and apoptosis regulation. The effect of HKII and its
mutants on neuronal survival was studied using a sensitive technique based on
co-transfecting embryonic rat primary cortical neurons with eGFP (green cells)
and HKII or HKII mutant vectors. These co-transfected cells were co-cultivated
with primary neurons expressing m-orange (orange cells) and subsequently
submitted to an in vitro model of cerebral ischemia (oxygen-glucose-
deprivation, OGD), (glucose-deprivation, GD) or (oxygen-deprivation, OD),
respectively. The ratio of green vs. orange neurons before and after the
damaging event was analysed. Thereby the effect of different HKII mutants on
neuronal survival could be determined. The data demonstrates that
mitochondrial binding of HKII is a dynamic and adaptive response mediated by
protein kinase B (PKB)/Akt kinase dependent phosphorylation, that protects
neurons from OGD induced apoptosis. It is proposed that HKII may serve as a
molecular switch regulating apoptosis in a glucose concentration depending
fashion and may those provide a link between cellular metabolism and survival.
These results might also have a therapeutic implication for vascualar diseases
like stroke
