Der t-Haplotyp der Maus (t), eine variante Form des Mauschromosoms 17, bewirkt
in heterozygoten t/+-Männchen eine Verschiebung der Vererbungsrate zu seinen
Gunsten. Diese nicht-mendelsche Vererbung ist das Ergebnis eines Signalweges,
in dem mehrere Distorter additiv auf die Spermien-Motilitäts-Kinase, SMOK1,
wirken und diese in allen Spermienzellen übermäßig stark aktivieren. Diese
Hyperaktivierung wird durch die Wirkung des t-Komplex Responders, TCR, nur in
den Spermienzellen normalisiert, die auch den Responder-Genlocus tragen. Die
Spermien, die zusätzlich zu den Distortern auch unter dem Einfluss des
Responders stehen, besitzen somit einen Vorteil, was zu einer höheren
Befruchtungswahrscheinlichkeit führt. Wie dieser Vorteil genau erreicht wird,
ist nicht bekannt, da bislang keine direkten Interaktionspartner oder
Zielmoleküle für SMOK1 beschrieben waren. Mit Hilfe der Hefe-Zwei-Hybrid
Methode konnten in dieser Arbeit sowohl Bindungspartner (Preys) für SMOK1 als
auch für mehrere Distorter-Proteine identifiziert werden. Weiterführend und
basierend auf einer Auswahl wurden fünf dieser Preys (Ammecr1, Akap9, Rhpn1,
Spata22, Dnali1) auf ihre mRNA- und Protein-Expression im Hodengewebe und in
Spermatozoen untersucht. Durch elektronenmikroskopische Studien, die den
genauen Expressionsort der Prey-Proteine zeigen, konnte die Kolokalisation von
TCR bzw. SMOK1 und den Preys an subzellulären Strukturen des
Spermienschwanzes, wie der Fibrous Sheath und den Outer Dense Fibers,
abgeleitet werden. Ein Teil der Hefe-Zwei-Hybrid Interaktionen wurde
schließlich in Säugerzellen durch Interaktionsstudien wie der Lumineszenz
basierten IP Analyse und der bimolekularen Fluoreszenzkomplementation, sowie
der klassischen Pull-Down Untersuchung untermauert. Zusätzlich wurden neue
Verknüpfungen beobachtet, die in der Hefe nicht identifiziert wurden. In einer
weiteren Analyse konnte eine direkte Bindung von SMOK1 an die GTPasen RAC1 und
RHOA aber nicht an CDC42 gezeigt werden. Diese Bindungen lassen vermuten, dass
RAC1 und RHOA zum Teil direkt die Aktivität von SMOK1 beeinflussen könnten. Die
identifizierten Protein-Protein-Interaktionen wurden abschließend in einem
vergrößerten Netzwerk zusammengefasst. Sie zeigen, dass sowohl SMOK1 als auch
die Distorter- und RHO-GTPasen über Scaffold-Proteine wie AKAP9 und RHPN1 an
flagellären Strukturen gebunden sein können. Die direkten Bindungen von zwei
der getesteten GTPasen (RAC1 und RHOA) an SMOK1, konnte die im molekularen
Modell dargestellte Distorter-RHO-SMOK1 Verknüpfung erstmals bestätigen. Die
Distorter-RHO-Komplexe könnten demzufolge direkten mit SMOK1 in Verbindung
stehen. Zudem konnte eine Interaktion von SMOK1 mit einem Bestandteil der
inneren Dyneinarme (DNALI1) beobachtet werden, die möglicherweise über einen
SMOK1-AMMECR1-Komplex erreicht wird. Die Verbindung zwischen SMOK1 und DNALI1
zeigt zum ersten Mal, dass die Kinase in der Lage sein könnte am Axonem mit
der Komponente eines Dyneinkomplexes zu interagieren. Durch eine gezielte
Wirkung von SMOK1 am Dyneinbestandteil DNALI1 könnte diese Interaktion die
Flagellenbewegung beeinflussen und somit eine gestörte Motilitätsphänotyp
verursachen. Die Ergebnisse dieser Arbeit tragen somit dazu bei den Signalweg
der nicht-mendelschen Vererbung in der Maus besser zu verstehen.The t-haplotype of the mouse (t), which is a variant form of mouse chromosome
17, causes the preferred transmission of the t allele from heterozygous males
(t/+). This non-Mendelian inheritance results from effects on a signalling
pathway, where the presence of several distorter genes additively
hyperactivate the sperm motility kinase, SMOK1, in the whole sperm population.
This hyperactivation is balanced by the t-complex responder, TCR, only in
spermatozoa carrying the responder gene. Spermatozoa influenced by the
distorters and by the responder have a motility advantage, resulting in a
higher probability for fertilization. It is still unclear how this advantage
is manifested, as no interaction partners or targets are yet known for SMOK1.
New binding partners for SMOK1 and for the distorters were identified in this
study using the yeast two-hybrid method. Based on selection criteria, five prey
candidate genes (Ammecr1, Akap9, Rhpn1, Spata22, Dnali1) were tested for mRNA
and protein expression in testis and spermatozoa, respectively. The co-
localization of SMOK1 or TCR with the prey proteins could be deduced within
subcellular structures, such as the fibrous sheath and the outer dense fibers of
the sperm flagellum, using electron microscopy. The protein-protein
interactions identified by yeast two-hybrid were, in part, verified in a
mammalian system using a luminescence-based immunoprecipitation analysis and a
bimolecular fluorescence complementation assay, as well as classical pull-down
studies. In addition, new protein-protein interactions were observed, which
were not identified by the yeast two-hybrid analysis. Further studies revealed
the direct interaction between SMOK1 and the GTPases RAC1 and RHOA, but not
CDC42. This evidence gives rise to the idea that the GTPases RAC1 and RHOA are
able to modify SMOK1 activity by binding to it directly. Finally, the
identified protein-protein interactions were summarized in an interaction
network. The interaction studies showed that SMOK1, as well the distorters and
RHO proteins, are bound to flagella via scaffolding proteins like AKAP9 or
RHPN1. Furthermore, the direct binding of two GTPases (RAC1 and RHOA) to SMOK1
confirm the link between distorters, RHO-proteins and SMOK1, which is predicted
by the molecular model of TRD. The novel interaction of SMOK1 to a component
of the inner dynein arms (DNALI1) was additionally observed. This interaction
could potentially be generated by a SMOK1-AMMECR1 complex. The specific
modification of DNALI1 by SMOK1 could negatively affect the movement of the
sperm flagellum, and therefore generate the motility phenotype, leading to non-
Mendelian inheritance in males. In summary, the results of these studies
clarify our understanding of the signalling pathway leading to non-Mendelian
inheritance of the t-haplotype
