The goal of this work was to develop helical conformations by using synthetic
foldamers that could be functionally modulated to selectively disrupt
unfavourable helix-helix interactions. Adhering to the principle of “equal
backbone atoms”, the alternating βγ sequence appears to be well-suited to
mimic an α-helical conformation. As a case study, the backbone modification is
applied to a natural helical protein folding motif, the α-helical coiled coil.
First an extended sequence of and amino acids was substituted in a coiled coil
forming sequence. The helical structure is induced through oligomerization
while the individual βγ segment is mostly unstructured. The natural side
chains were preserved to more accurately imitating natural packing of αβγ
chimera. The self- and hetero-assembly of a series of αβγ-chimeric sequences
is investigated in model peptide systems as well as the biologically-derived
GCN4pLI sequence by means of a variety of theoretical and experimental methods
and assays, such as MD simulations, CD, SEC, AU, TEM, as well as FRET,
disulfide exchange and template-directed native chemical ligation assays. The
next task was to optimize the interactions between the artificial sequence and
the native partner by means of two medium-throughput methods. Spot
synthesis/analysis and phage display techniques revealed the key side chain
properties that are required for coiled coil assembly. The phage display
technique selected α-sequences with primary structures that would not have
been considered in a rational design approach, but were observed to be better
binding partners for the αβγ-chimera. Further, the function of the artificial
folding motif was studied in the context of its catalytic activity in the
native chemical ligation. In order to bring the essential functional groups
together and present a well-formed catalytic site, αβγ-chimera had to be and
were shown to mimic the natural α-helical coiled coil structure. The
structural consequences of the ααα→βγ isosteric backbone substitution, such as
disruption in local packing or conformational degrees of freedom due to
further loss of H-bond are other interesting aspects which were studied in
detail. As determined by disulfide exchange assays, the pairing of αβγ-
chimeric sequences with the native GCN4pLI sequence is thermodynamically
allowed only in the case of an ideal arrangement of β- and γ-residues. This
indicates a similarity in the local side chain packing of β- and γ-amino acids
at the helical interface of αβγ-chimeras and the native α-peptide. Altogether,
the observations are consistent with the theoretical studies and show that the
stability of a αβγ-peptide bundle can be tuned by controlling the extent of
the side chain interactions at the interhelical recognition domains.Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit synthetischen β,γ-Foldameren, die
dazu designed worden, die α-helikale Konformation zu imitieren. Im Rahmen der
Wirkstoffentwicklung könnte es mit Hilfe derartiger Strukturen ermöglicht
werden, Einfluss auf unerwünschte z.B. im Rahmen bestimmter Krankheiten
auftretenden Protein-Protein-Interaktionen zu nehmen. Basierend auf dem
Prinzip, die Anzahl der Atome im Peptidrückgrat konstant zu halten, sollten
alternierende Sequenzen aus β- und γ- Aminosäuren eine der α-helikalen
Konformation nahe kommende Struktur einnehmen. Als Modell, um diese Hypothese
zu überprüfen, wird im Rahmen dieser Studie das α-helikale Coiled-Coil-
Faltungsmotiv verwendet. Hierzu wurde ein Segment einer Coiled-Coil bildenden
α-Sequenz durch β- und γ-Aminosäuren ersetzt, um somit ein α,β,γ-Chimär zu
generieren. Das Design der α,β,γ-Sequenz wurde dabei so gewählt, dass die
natürlichen Seitenketten beibehalten wurden, um dadurch das native
Packungsmuster zu gewährleisten. Die Helixbildung in diesem System wird durch
Oligomerisierung induziert, während die isolierte β,γ-Sequenz größtenteils
unstrukturiert vorliegt. Im Folgenden wurden verschiedene α,β,γ-Chimäre
hinsichtlich ihrer Oligomerisierung sowohl an dem Modell als auch im Rahmen
einer natürlich vorkommenden Coiled-Coil-Sequenz, GCN4pLI, untersucht. Dabei
kam eine von Vielzahl von theoretischen und experimentellen Methoden und
Assays wie Molekulardynamic-Simulationen, CD-Spektroskopie, Größenausschluss-
Chromatografie, analytische Ultrazentrifugation, Transmissionselektronen-
Spektroskopie sowie auch Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer, Disulfid-
Austauschexperimente und „Native Chemische Ligation“ zur Anwendung. Im
Anschluss an diese Untersuchungen wurden mit Hilfe zweier Medium-Throughput-
Methoden (Spot-Synthese und Phage-Display) optimale Interaktionspartner für
die artifizielle α,β,γ-Sequenz identifiziert. Während der rationale Ansatz bei
der Spot-Synthese von vorn herein bestimmte Sequenzen ausschloss, schöpfte die
Phage-Display-Technik aus dem gesamten Pool codierter Aminosäuren, sodass
hiermit dem Wildtyp zwar strukturell wenig ähnelnde jedoch strukturell
stabilere Bindungspartner gefunden werden konnten. Die Funktion des
künstlichen Faltungsmotivs wurde im Kontext der templat-gesteuerten „Nativen
Chemischen Ligation“ untersucht. Um die reaktiven funktionellen Gruppen in
räumliche Nähe zu bringen, muss die α,β,γ-Sequenz die natürliche α-helikale
Struktur imitieren können. Diese Eigenschaft konnte im Rahmen dieser
Untersuchungen bestätigt werden. Weitere Auswirkungen der strukturellen
Veränderungen durch den isosteren α,α,α→β,γ-Austausch, wie z.B. Verlust
lokaler Packung und Gewinn an konformationeller Flexibilität durch die
Eliminierung von Wasserstoffbrücken im Rückgrat wurden ebenfalls untersucht.
In Disulfid-Austausch-Experimenten konnte gezeigt werden, dass die Paarung der
chimären Sequenz mit der natürlichen GCN4pLI-Sequenz thermodynamisch nur
erlaubt ist, wenn die β- und γ-Reste einer bestimmten Sequenz (βγβγ) folgen.
Dies weist darauf hin, dass nur in diesem Fall die lokale Packung der Reste
dem natürlichen Packungsmuster hinreichend ähnlich ist. Diese Beobachtungen
stimmen mit den theoretischen Studien überein und zeigen, dass die Stabilität
der Interaktionen mit α,β,γ-chimären Sequenzen durch das Ausmaß an
Wechselwirkungen zwischen den Seitenketten in der helikalen Interaktionsdomäne
kontrolliert werden kann
