Tez (Yüksek Lisans) -- İstanbul Teknik Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, 2014Thesis (M.Sc.) -- İstanbul Technical University, Institute of Science and Technology, 2014Kronik Hepatit B hastalığı evrensel bir sağlık problemidir. Hepatit B hastalığına sebep olan Hepatit B virüsünün, tüm dünyada 2 milyardan fazla kişiyi enfekte ettiği bilinmektedir. 400 milyondan fazla kişi ise kronik olarak hepatit B taşıyıcısıdır ve bu taşıyıcılık, kronik hepatit başta olmak üzere, karaciğer kanseri ve karaciğer sirozunun oluşmasına sebep olabilmektedir. Yıllık olarak bakıldığında tüm dünyada, 2 milyon kişinin bu virüsten dolayı hayatlarını kaybettiği kayıtlara geçmektedir. Türkiye’de ise yaklaşık 3 milyon kişinin bu hastalıkla mücadele ettiği biliniyor. Hepatit B virüsü küçük bir DNA virüsüdür ve yaklaşık olarak 3200 baz çiftine sahiptirler. Hepatit B virüsü Hepadonovirus ailesinin bir üyesidir ve kısmi olarak çift sarmallı, dairesel DNA içerir. Genom üzerinde 4 tane protein kodlayacak nükleik asit dizisi vardır. Bunlar S, C, X ve P bölgeleri olarak adlandırılan yüzey, kor, X ve polimeraz proteinleridir. C geni, HBcAg proteinlerini kodlar ve bu kor nükleokapsid oluşumuna sebep olan yapısal proteinleri içerir. Bu proteinler HBeAg antijenine translasyon sonrası dönüşür. S genini içeren Pre S1 ve Pre S2 yüzey proteinleri HBsAg anijenlerini kodlar. P geni DNA polimerazı kodlayan protein, ters transkripsiyon aktivitesine sahiptir ve son olarak X geni hücrenin potansiyel transaktivatörüdür. X geninin görevi ise tamamen bilinmemektedir. Genom üzerinde, 6 başlangıç kodonu, 4 promotör ve 2 tane hızlandırıcı element bulunmaktadır. Hepatit B virüsünün tüm genomik sekansının üzerinde 8 genotipi tanımlanmıştır ve bunlar A’dan H’ye kadar düzenlenmiştir. Bağlantılı olarak, HBV’nin alt tipleri (adw, adr, ayw ve ayr) de mevcuttur. A’dan H’ye düzenlenen bu 8 genotip farklı coğrafik bölgelerde yayılım göstermiştir. xxiv Hepatit B virüsü konak hücreye invaze olduğu zaman, hücre yüzeyine bağlanır ve bu hücreye kendi zarf proteinleri yardımıyla girer. Virüs, hücrenin plazma membranından nükleusa taşınır. Bu şekilde nükleusa giren virüs kısmen sirküler formdan sirküler DNA (cccDNA) formuna dönüşerek öncül RNA ve haberci RNA’ya kalıp oluşturur. Virüsün negatif zinciri neredeyse tamamen halkasal yapıda olmasına rağmen, pozitif zincirin uzunluğu daha kısadır. Negatif zincir virüsün yapısal proteinlerini kodlarken, pozitif zincir bazı yapısal proteinleri kodlar. Translasyon sonucu oluşan viral proteinler nükleokapsid içinde toplanır ve paketlenir. Daha sonra yeni hepatositleri işgal etmek üzere sitoplazmadan salınır. Hayatı tehdit eden bu virüsün bulaşma yolları şu şekildedir: Enfekte olmuş kan temasları, korunmasız olarak yapılan cinsel aktivite, organ nakilleri, yatay olarak meydana gelen bulaşma, hastane yaralanmaları ve intravenöz ilaç kullanımı olarak özetlenebilir. Ayrıca bu hastalık anneden bebeğe doğum esnasında da geçebilir. Yapılan çalışmalar, hepatit B virüs enfeksiyonunun progresyonunda sadece viral genotip ve vireminin değil, aynı zamanda konak genetik faktorlerinin de oldukça önemli rol oynadığını göstermiştir. Aynı zamanda, hem hücresel hem de hümoral immün yanıtın virüsün eredike edilmesi için gerekli olduğu birçok deneysel çalışmada gösterilmektedir. Temel olarak kronik hepatit B hastalığının tedavisinin amacı, viral replikasyonu baskılamak ve geri dönülemez karaciğer zararlarını en aza indirgemektir. Öte yandan, uzun süreli tedavinin amacı ise virüsü elimine ederek hastalığın progresyonunu önlemek. İnterferon ve lamuvidin kronik Hepatit B hastalığının tedavisinde kullanılan yaygın ajanlardır. Tedavide kullanılan diğer ajanlar ise adefovir dipivoksil (ADV), tenofovir disoproksil fumarat (TDF), entecavir (ETV) and telbivudin(LdT)dir. Kromozomun 6p21.3 bölgesinde yer alan yüksek derecede polimorfik insan lökosit antijen (HLA) geni immün yanıtla çok yakından ilişkilidir.Ayrıca bu polimorfik bölge inflamasyondan, enfeksiyondan ve otoimmüniteden de sorumludur. Genomun tarandığı (genome wide association-GWA) çalışmalar kromozomun 6p21 noktasının yakınında bulunan insan lökosit antijende ki, binlerce tek nükleotid polimorfizmini ortaya çıkartmıştır. Daha önceki çalışmalara göre HLA lokusunda bulunan ve kronik HBV, HCV, hepatik fibroz ve gelişen karaciğer kanser xxv hücreleriyle bağlantılı olabilen aday tek nükleotid polimorfizmleri belirlenmiştir. Genomun tarandığı çalışmalarda HLA-DPB1 gen bölgesinin Hepatit B hastalığı ile ilişkili olabileceği üzerine veriler elde edilmiştir. Bu bölgenin polimorfik bir bölge olmasından dolayı Hepatit B hastalarında hastalık direncine bakarak DPB1 allel tayini yapmak ve elde edilecek verilere göre allellerin hastalık için direnç ya da yatkınlıklarını incelemek bu çalışmanın temel amacıdır.Biz bu çalışma ile Türk populasyonunda, Hepatit B hastalığının immün yanıtta önemli bir rol oynayan HLA sınıf II bölgesi genlerinden HLA-DPB1 polimorfizmleri ile ilişkisini araştırarak, aday alellerin ve koruyucu alellerin belirlenmesini hedefledik. Bu çalışma 94 hasta içermektedir. Bu hastalar Göztepe Eğitim ve Araştırma Hastanesi’nde hepatoloji kliniğinden takipli hastalardır. Yaş ve cinsiyetle eşleşmiş 85 HBsAg negatif, anti- HBs pozitif ve anti-Hbc IgG spontan serokonverted pozitif hastalar katılmıştır. Yerel etik kurulu onayı alınmştır. Kan örneklerinden genomik DNA izolasyonu sonucu HLA-DPB1 bölgesine spesifik primerler ile istenilen bölge polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) ile çoğaltılmıştır. Bu çalışmanın ardından PZR-RFLP (Restriction Fragmen Length Polimorpism) metodu uygulanarak restriksiyon enzimi ile kesim gerçekleştirilir. Bu çalışmada 9 farklı restriksiyon endonukleaz kullanılmıştır: Bunlar, Bsp12861, FokI, DdeI, BsaJI, BssHII, Cfrl31, RsaI, EcoNI ve AvaII’dir. Restriksiyon enzim kesiminden sonra kesim bölgeleri incelenerek, allel tayini yapılmıştır. Çalışmaya 94 kronik hepatit B hastası (Grup A) alınmıtır. Bu hastalar Göztepe EAH karaciğer hastalıkları polikliniğinde kayıtlı 6 aydan uzun süredir serum HBsAg (hepatit B yüzey antijeni) pozitif olan hastalardır. Hastaların ortalama yaşı 47,9±14,7 dir. Hastaların %61.7’si (n=58) erkek, %75,5 (n=71) HBeAg (hepatit B early antigen) negatiftir. Hastaların %57,4(n=54) ‘e karaciğer biopsisi yapılmıştır, Biyopsi yapılan hastalarda HAI (hepatik aktivite skoru) 6,5 ±3,3 Fibroz skoru 2±1,5 dir. Hastaların %21,3’ünde (n=20) karaciğer sirozu mevcuttur, %83’ü(n=78) hepatit B’ye yönelik tedavi almaktadırlar. Ortalama serum ALT düzeyleri 102,1±113, AST 70±96 dir. Hastaların ortalama izlem süreleri 76 ±52 aydır. Kontrol grubu olarak (Grup B) hepatit B geçirmiş, spontan HBsAg serokonversiyonu olmuş sağlıklı kişiler alınmıştır (HBsAg negatif, Anti HBs pozitif, Anti HBcIgG pozitif). Kontrol grubunda erkek oranı %54 yaş ortalaması 54±13. xxvi Hastalıkla ilişkili olduğu düşünülen daha önce yapılmış çalışmalardan, Türk ve Alman populasyonlarından oluşan tarihsel kontrol (Grup C) olarak adlandırılan çalışma grubunu inceledik. Bu çalışma grubu Hepatit B hastalığıyla ilintili olan populasyonlarda HLA-DPB1 frekansını karşılaştırmak için kullanıldı. Analizi yapılan 19 DPB1 alelinde, DPB1*15:01 aleli, kontrol grubunda hepatit B’ye sahip olan hastalara göre daha fazla gözlemlenmiştir. DPB1*02:01 ve DPB1*10:01 ise kontrol grubunda fazla görülen diğer alellerdir. Bu iki alel Bonferoni düzeltmesinden sonra önemini kaybetmiştir. Sadece DPB1*15:01 aleli pChronic Hepatitis B Infection is a global health problem that affects more than 2 billion people all around the world. Furthermore, more than 400 million people are chronic carriers of this virus that can lead to chronic hepatitis, liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma. Annualy 2 million people die owing to the this virus throughout world. In Turkey, it is known that 3 million people suffer from Chronic Hepatitis B disease. Hepatitis B virus (HBV) is a small DNA virus and is a member of hepadnaviruses that includes a partially double-stranded circular DNA containing approximately 3200 base pairs. Once the Hepatitis B virus invades the body, it binds to the cell surface and penetrates to the host cells with the help of its envelope proteins. The virus is transported in to the nucleus from the plasma membrane of the cell. After that, the partially circular DNA is made into covalently closed circular DNA (cccDNA) to be used as a template for pregenomic RNA and mRNA. Even though, the negative strand of virus is almost a complete circle, the second strand, pozitive strand, is shorter in length. The negative strand encodes the structural proteins of the virus whereas the pozitive strand encodes some of the structural proteins and overlaps with most parts of the negative strand. Hepadnaviruses depends on reverse transcription of negative-strand DNA which is transcribed by the DNA polymerase from a “pregenomic” RNA intermediate. Viral proteins are translated by the mRNA, then the proteins and genome are packaged into virions and transported out of the cell to infect new hepatocytes. This potentially life threatining virus is spread by contact with the infected blood, unprotected sexual activity, organ transplantation, horizontal, nosocomial injury and intravenous drug use. It can also transmitted from mother to infant at birth. Furthermore, host genetic factors play a significant role in the pathogenesis. Mainly, the aim of the treatment for chronic hepatitis B is to supress viral replication and to induce remission before the significant irreversible liver damage. On the other hand, the long-term goal of treatment is to eliminate the virus, prevent disease xx progression and to improve patient survival. Interferon and lamivudine are the most widely used agents for the treatment of chronic hepatitis B diseases. Other used agents are adefovir dipivoxil (ADV), tenofovir disoproxil fumarate (TDF), entecavir (ETV) and telbivudine (LdT). The human leukocyte antigen (HLA) encodes the major histocompatibility complex (MHC) in humans and this region of the genome is critical for inflammation, infection and autoimmunity. Studies have shown that HLA class II molecules, which show high polymorphism, and cytokines are the susceptibility factors of chronic HBV infection. Genome-wide association study (GWAS) can methodically investigate hundreds of thousands of single nucleotide polymorphisms (SNPs) that are located near HLA loci in chromosome 6p21.According to previous studies, GWAS determined candidate SNPs of the HLA loci that are related with chronic HBV or HCV infection, hepatic fibrosis and hepatocellular carcinoma. Moreover, recent GWAS done on chronic hepatitis B infected patients revealed SNPs in HLA class II genes, especially HLA-DPA1 and HLA-DPB1 region. In this line, our work aims to determine alterations in the HLA-DPB1 site of the genome of HBV infected Turkish patients and link these possible polymorphisms to disease associations in Turkish population. In this study, a total of 94 patients (Group A) were included, from Department of Gastroenterology, Goztepe Teaching and Research Hospital. These hepatitis B patients who were followed up at hepatology clinic and, age and gender matched 85 HBsAg negative, anti-HBs positive and anti –Hbc IgG positive spontaneous seroconverted healthy subjects (Group B) were enrolled. We also used historical controls as Group C by taking disease related information directly from the published literature, which includes Turkish and German populations. Group C is used to compare HLA-DPB1 frequencies from general population with the disease population of this study. Local ethics committee approval was taken. Genomic DNA was extracted from peripheral blood samples. HLA DPB1 alleles were determined by restriction fragment length polymorphisms–polymerase chain reaction at medium resolution. 9 different restriction endonucleases were selected for digestion to detect allele-specific cleavage after PCR-amplification of the DPBl alleles.The distribution of the alleles among patients and control subjects were analyzed. xxi Among the 19 analyzed DPB1 alleles in this study, DPB1*02:01 was the most prevalent (genotyped in 30.2% of patient and control groups). DPB1*15:01 allele was more frequent in the spontaneous seroconverted control group compared to chronic hepatitis B patients (15.3% vs. 1.1%, χ2=12.5, OR=0.06, 95% CI=0.08-0.046 p<0.001,pcYüksek LisansM.Sc
