Next generation sequencing to discover genes for Mendelian disorders

Abstract

Cobalamin is an essential vitamin in mammals. In cells, adenosylcobalamin and methylcobalamin act as cofactors to enzymes methylmalonyl CoA mutase and methionine synthase, respectively. Inborn errors of Cbl metabolism are rare Mendelian disorders associated with hematological and neurological manifestations, and elevations of methylmalonic acid and/or homocysteine in the blood and urine. These disorders have traditionally been exclusively diagnosed by somatic cell complementation analysis. 131 DNA samples from patients with elevated methylmalonic acid and no diagnosis following somatic cell complementation analysis were analyzed using a 24 gene extended cobalamin metabolism next generation sequencing based panel. This study identified two or more variants in a single gene in 16/131 patients, with eight patients having pathogenic findings, one a finding of uncertain significance, and seven benign findings. Of the patients with pathogenic findings, five had mutations in ACSF3, two in SUCLG1 and one in TCN2. It was suspected that the Cbl gene panel would not provide a diagnosis for one patient with elevated methylmalonic acid and homocysteine, who was suspected to have an inborn error of cobalamin metabolism. He had decreased incorporation of [14C] propionate and 5-methyltetrahydrofolate, but could not be diagnosed as any known complementation groups. Indeed, whole exome sequencing (WES) revealed that he did not have mutations in any of the genes known to be associated with Cbl metabolism. WES data identified c.851T>G (p.L284*) and c.1019C>T (p.T340I) in ZNF143 as causative for this patient's disease. ZNF143 is a transcription factor whose role in Cbl metabolism has not been previously studied. The patient had a unique cellular phenotype of accumulation of TC-Cbl in his fibroblasts. qRT-PCR analysis revealed low MMACHC expression levels both in patient fibroblasts, and in control fibroblasts incubated with ZNF143 siRNA. The work described in this thesis was performed as part of the Rare Disease Collaboration for Autosomal Loci (RaDiCAL), which is an initiative that aims to discover DNA variants causing Mendelian diseases. In addition to the identification of variants causing disease, this thesis describes RaDiCAL's informed consent and consideration for inclusion of the right not to know.Cobalamine est une vitamine essentielle chez les mammifères. Dans les cellules, l'adénosulcobalamine et la méthylcobalamine agissent comme cofacteurs pour les enzymes méthylmalonyl-CoA et méthionine synthase respectivement. Les erreurs innées du métabolisme de la Cobalamine sont de rares maladies héréditaire mendéliennes qui se manifestent par des complications hématologiques et neurologiques, ainsi que par une augmentation du taux d'acide méthylmalonique et/ou d'homocystéine dans le sang et l'urine. Traditionnellement, ces maladies génétiques sont exclusivement diagnostiquées par une analyse de complémentation des cellules somatiques. 131 échantillons d'ADN provenant de patients non-diagnostiqués après une analyse de complémentation des cellules somatiques et avec un taux élevé d'acide méthylmalonique ont été analysés utilisant une plateforme de séquençage nouvelle génération contenant les 24 gènes du métabolisme de la cobalamine. Cette analyse a identifié deux variantes ou plus dans un seul gène chez 16/131 patients. De ces 16 patients, huit avaient des résultats pathogéniques, un avait des résultats d'importance incertaine et sept démontraient des résultats bénins. Chez les patients avec des résultats pathogéniques, cinq patients possédaient une mutation dans le gène ACSF3, deux patients avaient une mutation dans le gène SUCLG1 et un patient avait une mutation dans le gène TCN2. Toutefois, la plateforme de gènes du métabolisme de cobalamine n'a pas fourni de diagnostic pour un patient ayant un taux élevé d'acide méthylmalonique et d'homocystéine et qui était soupçonné d'avoir une erreur de métabolisme de cobalamine. Ce patient avait une incorporation de [14C] propionate et 5-méthyltétrahydrofolate, mais ne pouvait pas être diagnostiqué selon les groupes de complémentation. Le séquençage de l'exome entier pour ce patient n'a révélé aucune mutation dans les gènes associés au métabolisme de cobalamine. Cependant, les données du séquençage de l'exome entier ont identifié deux mutations, c.851T>G (p.L284*) et c.1019C>T (p.T340I), dans le gène ZNF143 comme étant la cause de la maladie chez ce patient. ZNF143 est un facteur de transcription qui n'a jusqu'à présent pas été associé avec le métabolisme de cobalamine. Ce patient avait un phénotype cellulaire unique caractérisé par l'accumulation de TC-Cbl dans ses fibroblastes. Une analyse qRT-PCR a démontré une faible expression du gène MMACHC dans les fibroblastes de ce patient ainsi que dans des fibroblastes témoins incubés avec des ZNF143 pARNi. Le travail décrit dans cette thèse a été réalisé dans le cadre du projet collaboratif "Rare Disease Collaboration for Autosomal Loci (RaDiCAL)", qui vise a identifier des variantes d'ADN causant des maladies héréditaires mendéliennes. En plus d'identifier des variantes d'ADN causant des maladies, cette thèse décrit les formulaires de consentement développés pour le projet RaDiCAL incluant l'option de refuser une prise de connaissance