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Abstract

微型真核生物（原生生物和单细胞真菌）在海洋微食物网的物质循环和能量流动中发挥着重要作用。然而目前对黄渤海海域和近岸典型海岸带区域底栖环境中微型真核生物的多样性、群落结构组成和生物地理分布的研究较少，数据资料欠缺。本工作利用高通量测序、定量PCR等方法对该区域底栖真核生物群落及其特定类群开展了如下三方面的研究工作： （1）山东荣成天鹅湖海草床系统中微型真核生物的遗传多样性、群落结构及分布规律的探讨。通过对海草床生态系统海草定植区与无海草区共10个沉积物样品进行18S rDNA的Miseq高通量测序及定量PCR实验，研究了海草床生态系统微型真核生物分子多样性及群落结构变化情况。结果表明：在以97%序列相似性划分OTU的情况下，顶复门（Apicomplexa）原生动物Lecudina polymorpha序列占绝对优势，其平均相对丰度高达83.2%。前人研究表明该类海洋顶复门原生动物通常是海洋无脊椎动物的寄生虫，因此探测到大量该顶复门类群的序列暗示海草床沉积物中无脊椎动物的大量存在。底栖微型真核生物的OTU丰富度与重金属浓度（如Cd、As）呈显著负相关。ANOSIM分析显示草区与无草区沉积物中微型真核生物群落结构差异显著；Simper分析表明真菌是造成海草定植区与无海草区微型真核生物群落差异的主要类群。从冗余分析（RDA）结果来看，海水盐度与沉积物孔隙水中氨氮的浓度是影响该区域底栖微型真核生物群落的主要环境因素。为了估算L. polymorpha类群18S rDNA基因在沉积物样品中的拷贝数，专门设计了针对该类群特异性qPCR引物并应用于沉积物样品。结果表明：该顶复门类群18S rDNA基因拷贝数在草区显著高于无草区；其拷贝数与上覆水叶绿素a含量呈显著正相关，与沉积物粒径中值粒径、孔隙水中铵离子浓度显著负相关。该研究是首次对海草床沉积物中微型真核生物群落组成、分子多样性及数量进行刻画，显示该系统中微型真核生物群落组成具有特殊性，为理解微型真核生物对海草定植的响应及相互作用积累了重要数据。 （2）通过对渤海、北黄海及南黄海底栖微型真核生物18S rDNA 焦磷酸测序数据的挖掘，研究了这三个海域表层沉积物中纤毛虫群落组成及生物地理分布。结果表明：上述海域表层沉积物中纤毛虫群落主要由旋唇纲（Spirotrichea）、寡膜纲（Oligohymenophorea）及线口纲（Litostomatea）组成。BIOENV结果显示，尾柱目（Urostylida）及后口目（Apostomatida）相对丰度与沉积物中硝酸盐及亚硝酸盐浓度显著相关。该区域底栖纤毛虫α-多样性及群落结构主要受地理区域的影响，而季节性较弱。偏Mantel检验（partial Mantel test）结果显示，相比于环境因子及离岸距离，水体深度对底栖纤毛虫群落结构变化起主导作用。典范对应分析（CCA）结果表明，在已测的所有环境因子中，温度、pH、盐度、水体深度及Zn2+浓度是驱动底栖纤毛虫群落结构变化的主要因素。该研究弥补了前人研究中对底栖微型真核生物群落中特定类群分析的不足；结果表明，黄渤海纤毛虫与底栖微型真核生物具有类似的分布规律，即水体深度是决定底栖纤毛虫群落结构的主要环境因素。 （3）缘毛类纤毛虫ITS区间特异性引物的设计与应用。本研究针对缘毛类纤毛虫ITS区设计了特异性引物，并结合已有的引物序列，对来自表层水和沉积物的4个环境样品进行了引物特异性扩增和克隆文库构建，通过文库序列的系统进化分析确定引物的特异性。结果显示本研究所得缘毛类纤毛虫ITS区引物具有较高的特异性。克隆文库结果显示，缘毛类纤毛虫在表层水和沉积物中具有不同优势物种，群落结构差异明显。所得结果基础上，分别比较了缘毛类纤毛虫18S rDNA V9区 和 ITS1, ITS2, ITS, 28S rDNA , ITS+ 28S rDNA 区序列间的遗传距离及其相关性，以筛选适用于缘毛类纤毛虫多样性研究的分子标记。序列相关性比较表明， ITS2区间序列变异性最高，且与18S rDNA有较好的相关性，为研究环境样品中缘毛类纤毛虫多样性与生态学研究提供了新的分子标记。 &nbsp