Mozzarella cheese is one of the most popular members of the Pasta Filata cheeses.The present research was aimed at\ud
investigating the microbial population of a raw milk Mozzarella cheese manufacture\ud
produced in the hinterland of the Marche region by using a commercial starter\ud
culture of thermophilic cocci. At this aim, both molecular and phenotypic\ud
assays were performed. The polyphasic approach utilized revealed an high diversity\ud
of the autochthonous LAB population investigated, both at the species and\ud
strain level.\ud
Keywords: Mozzarella cheese, autochthonous lactic acid bacteria, RAPD, PFGE,\ud
acidifying activit

Angelozzi, Marco

Aquilanti, Lucia

Ciarrocchi, Floriana

Clementi, Francesca

Italian

CamEPrints

SCIENZA E TECNICA LATTIERO-CASEARIA, 59 (4), 311-316 2008
* Corrispondenza ed estratti: f.ciarrocchi@univpm.it
1 Dipartimento di SAIFET, Università Politecnica delle Marche. Via Brecce Bianche, 60131 Ancona.
2 Sabelli S.p.A., z.i. Marino del Tronto, 63100 Ascoli Piceno.
CONTRIBUTO DELLA POPOLAZIONE LATTICA AUTOCTONA
IN UNA PRODUZIONE DI MOZZARELLA AL LATTE CRUDO
CON STARTER TERMOFILI COMMERCIALI
Floriana CIARROCCHI1*, Lucia AQUILANTI1, Marco ANGELOZZI2,
Francesca CLEMENTI1
INTRODUZIONE
Tra i formaggi a pasta filata, la cui tecnologia di caseificazione costituisce un
patrimonio della tradizione casearia italiana, la Mozzarella è quello più cono-
sciuto ed apprezzato. Tradizionalmente la produzione di Mozzarella prevede l’e-
sclusivo utilizzo di latte intero crudo nel quale, a seguito di un processo sponta-
neo di fermentazione, viene a svilupparsi una complessa associazione di micror-
ganismi. Oggi, la Mozzarella è generalmente prodotta con latte pastorizzato
addizionato di starter selezionati composti da uno o più ceppi di cocchi termofi-
li (Sreptococcus thermophilus) o da associazioni di cocchi e lattobacilli termofili
(Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus e/o Lb. helveticus) in grado di pro-
muovere e guidare il processo di acidificazione. Sebbene la pastorizzazione sia
una pratica introdotta a garanzia di una maggiore sicurezza microbiologica del
prodotto, numerosi studi hanno evidenziato come la microflora naturalmente
presente nel latte crudo rivesta un ruolo chiave nella definizione delle peculia-
rità sensoriali del formaggio [1]. Il presente lavoro ha avuto come obiettivo la
caratterizzazione della  popolazione lattica autoctona di una produzione al latte
crudo di Mozzarella dell’entroterra marchigiano ottenuta con uno starter com-
merciale di cocchi termofili, attraverso l’impiego di tecniche microbiologiche tra-
dizionali, molecolari e saggi fenotipici.
MATERIALI E METODI
Tre campionamenti su latte crudo (Lc), cagliata (Cc) e Mozzarella al latte
crudo (Mc) sono stati effettuati in un caseificio industriale della regione
Marche, nei periodi luglio 2004 (I e II campagna) e gennaio 2005 (III campa-
gna). Sono stati inoltre prelevati campioni dello starter commerciale (S) in uso
presso il caseificio (I e II campagna) e di Mozzarella a latte pastorizzato (Mp)
(III campagna) prodotta con il suddetto starter per isolare ceppi commerciali di
St. thermophilus da utilizzare come controllo. Per ciascun campione di Lc, Mc,
Cc sono stati contati e, successivamente, isolati: (i) lattobacilli su MRS incuba-
to a 37°C per 72 h; (ii) cocchi mesofili e termofili su M17 incubato rispettiva-
mente a 22°C e 45°C per 48 h e 72 h in anaerobiosi. Gli isolati Gram positivi e
catalasi negativi sono stati successivamente sottoposti ad identificazione mole-
colare mediante ARDRA (Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis) e
sequenziamento di una porzione del gene codificante il 16S rRNA [2]. La tipiz-
zazione genotipica è stata condotta solo sugli isolati ascritti alle specie di inte-
resse per il settore lattiero-caseario. In particolare l’analisi RAPD (Randomly
Amplified Polymorphic DNA) accoppiata all’analisi PFGE (Pulsed Field Gel
Electrophoresis) è stata eseguita sugli isolati ascritti a Lb. helveticus, Lc. lactis
ssp. cremoris e Lc. lactis ssp. lactis, mentre per le specie St. thermophilus, Lb.
gasseri e Lb. plantarum è stata condotta la sola analisi RAPD. Per l’analisi
RAPD sono stati utilizzati i primer D8635 [3] e 5’-AGC AGC GTG G-3’ [4].
L’analisi PFGE è stata condotta mediante estrazione e digestione con SmaI del
DNA genomico [5]. I profili elettroforetici ottenuti mediante analisi RAPD e
PFGE sono stati convertiti in una matrice binaria (0 = assenza e 1 = presenza
di banda) sulla base della quale è stata successivamente calcolata una matrice
di similarità [6]. L’analisi cluster è stata effettuata utilizzando il metodo
Unweigthed Pair Group Method with Arithmetic Averages (UPGMA) [7] ed il
software NTSYS, versione 1.8. Gli isolati ascritti a specie di interesse per la for-
mulazione di starter destinati alla produzione di Mozzarella (St. thermophilus
e Lb. helveticus) sono stati inoltre sottoposti a saggio dell’attività acidificante,
come precedentemente descritto [8]. I valori di pH, misurati dopo 6 ore di incu-
bazione a 36° C in Skim milk (SM), sono stati sottoposti ad analisi ANOVA, al
fine di individuare, all’interno di ciascuna specie, gli isolati caratterizzati da
attività statisticamente differenti (P < 0,05).
RISULTATI E DISCUSSIONE
Dall’enumerazione dei lattococchi mesofili, dei cocchi termofili e dei lattoba-
cilli nei campioni di Lc, Cc e Mc, prelevati nel corso delle prime due campagne
di campionamento, le conte più elevate sono state riscontrate nei campioni di
cagliata (valori compresi tra 7,8 e 9,5 Log UFC/g). Tuttavia, in entrambe le cam-
pagne, le conte dei cocchi termofili nella Mc sono risultate più alte rispetto a
quelle dei campioni di Lc e Cc.
L’identificazione genotipica dei 335 isolati Gram-positivi e catalasi negativi ha
permesso di osservare una microflora autoctona estremamente biodiversa  nei
campioni di Lc, Cc e Mc, in accordo a quanto osservato da altri autori in produzio-
ni di Mozzarella al latte crudo (Fig. 1) [10]. Tra i cocchi, la maggior parte degli iso-
lati è risultata ascritta ai generi Streptococcus (56 isolati) ed Enterococcus (82 iso-
lati), mentre tra i lattobacilli, Lb. helveticus è risultata la specie dominante (17 iso-
lati) (~ 49%). In particolare sono state isolate specie termofile (Lb. delbrueckii e Lb.
gasseri), mesofile (Lc. lactis ssp. cremoris, Lc. lactis ssp. lactis, Lb. gasseri, Lb. plan-
tarum, Lb. paracasei, Lc. garvieae), ed altre specie indice di ricchezza biologica del
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latte [10] (E. faecalis, E. faecium, E. gallinarum, St. gallolyticus, St. infantarius e
St. bovis). Come atteso, i 41 isolati ottenuti dai campioni di Mp e S sono risultati
appartenere alla specie St. thermophilus.
La biotipizzazione mediante RAPD ha permesso di individuare diversi livel-
li di eterogeneità genetica all’interno delle singole specie considerate (dati non
mostrati). Al fine di individuare eventuali ulteriori polimorfismi genotipici tra
gli isolati appartenenti alla specie Lb. helveticus, utilizzabile come starter per la
produzione di Mozzarella, è stata condotta l’analisi PFGE (Fig. 2). Attraverso la
clusterizzazione RAPD e PFGE, è stato possibile distinguere 6 genotipi per Lb.
helveticus, 12 genotipi per Lc. lactis ssp. cremoris e 9 genotipi per Lc. lactis ssp.
lactis. E’ interessante notare che, con l’eccezione della specie Lc. lactis ssp. lac-
tis, per tutte le specie testate, l’analisi PFGE ha evidenziato una maggiore ete-
rogeneità infraspecifica e quindi una maggiore capacità discriminante rispetto
all’analisi RAPD.
La caratterizzazione tecnologica è stata condotta sulle specie St. thermophi-
lus e Lb. helveticus. L’impiego di starter a composizione definita costituiti da St.
thermophilus e Lb. helveticus, infatti, consente di raggiungere tempi di produ-
zione più brevi e migliori proprietà funzionali [9]. Gli isolati provenienti dallo
Figura 1 – Ripartizione percentuale delle specie isolate nel corso delle prime due campa-
gne di isolamento da latte crudo (Lc), cagliata (Cc) e Mozzarella (Mc).
Figure 1 – Percent distribution of the species isolated from raw milk (Lc), curd (Cc) and
raw milk Mozzarella cheese (Mc) during the first two  isolation campaigns.
starter, tutti identificati come St. thermophilus, hanno mostrato, come atteso,
una elevata attitudine alla acidificazione, portando il  pH a valori prossimi o
inferiori a 5. Tra gli isolati naturali di St. thermophilus, l’isolato 355 (ottenuto
da Mc) e gli isolati 406, 407, e 428 (ottenuti da Mp) sono risultati in grado di rag-
giungere pH comparabili a quelli dei ceppi commerciali. Tra gli isolati apparte-
nenti alla specie Lb. helveticus, nessuno ha mostrato una altrettanto elevata
capacità, raggiungendo, per circa il 76 % dei casi, valori di pH superiori a 5,5.
Questo comportamento può essere spiegato dal fatto che la specie Lb. helveticus,
una specie omofermentante, termofila ed acidotollerante, presenta una lenta aci-
dificazione iniziale, che tuttavia risulta più intensa man mano che la fermenta-
zione procede. I risultati della clusterizzazione molecolare e dell’analisi ANOVA
effettuata sui dati dell’attività acidificante sono stati combinati al fine di defini-
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Figura 2 – PFGE-tipi ottenuti dagli isolati di Lb. helvetcus con l’endonucleasi SmaI. M
Marker.
Figura 2 – PFGE- types obtained by  SmaI- PFGE of Lb. helveticus isolates. M Marker.
re, all’interno delle specie di interesse per la produzione di Mozzarella i diversi
biotipi. Sono stati in tal modo definiti 6 biotipi per Lb. helveticus e 23 per St.
thermophilus.
RIASSUNTO – La Mozzarella è uno dei formaggi a pasta filata più conosciuti ed
apprezzati in Italia ed in altri paesi europei. Il presente lavoro ha avuto come
obiettivo lo studio della popolazione lattica autoctona di produzioni di
Mozzarella dell’entroterra marchigiano al latte vaccino crudo addizionato di uno
starter commerciale di cocchi termofili, attraverso l’impiego di tecniche micro-
biologiche tradizionali, molecolari e saggi fenotipici. L’approccio polifasico adot-
tato ha permesso di verificare una elevata biodiversità nella popolazione lattica
autoctona investigata, sia a livello di specie che di ceppo.
Parole chiave: Mozzarella, popolazione lattica autoctona, RAPD, PFGE, attività
acidificante
SUMMARY – Contribution of the autochthonous lactic acid bacteria population in a
production of raw milk Mozzarella cheese. – Mozzarella cheese is one of the most
popular members of the Pasta Filata cheeses.The present research was aimed at
investigating the microbial population of a raw milk Mozzarella cheese manufac-
ture produced in the hinterland of the Marche region by using a commercial star-
ter culture of thermophilic cocci. At this aim, both molecular and phenotypic
assays were performed. The polyphasic approach utilized revealed an high diver-
sity of the autochthonous LAB population investigated, both at the species and
strain level.
Keywords: Mozzarella cheese, autochthonous lactic acid bacteria, RAPD, PFGE,
acidifying activity
Ringraziamenti: Poster presentato al I Congresso Lattiero-Caseario AITeL.
Bologna, 12 giugno 2008 “Acquisizioni scientifiche e valorizzazione del latte e dei
derivati: aspetti genetici, ambientali e tecnologici”.
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Ciarrocchi et al (2008) Sci Tecn Latt-Cas, 59 (4), 311-316316


Contribution of the autochthonous lactic acid bacteria population in a\ud
production of raw milk Mozzarella cheese- CONTRIBUTO DELLA POPOLAZIONE LATTICA AUTOCTONA\ud
IN UNA PRODUZIONE DI MOZZARELLA AL LATTE CRUDO\ud
CON STARTER TERMOFILI COMMERCIALI

http://ecum.unicam.it/153/1/Ciarrocchi_et_al.pdf

Contribution of the autochthonous lactic acid bacteria population in a\ud production of raw milk Mozzarella cheese- CONTRIBUTO DELLA POPOLAZIONE LATTICA AUTOCTONA\ud IN UNA PRODUZIONE DI MOZZARELLA AL LATTE CRUDO\ud CON STARTER TERMOFILI COMMERCIALI

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