OYUNBOLD, LAMID-OCHIR

オユンボルド, ラミド オチル

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博士課程用（甲）  （様式4）(Form4)  学 位 論 文 の 内 容 の 要 旨 Dissertation Abstract  オユンボルド  ラミド オチル             OYUNBOLD    LAMID-OCHIR    印  （学位論文のタイトル） Title Bioluminescence Image as a Quantitative Imaging Biomarker for Preclinical Evaluation of Cryoablation in a Murine Model （担癌マウスに対する凍結療法の発光イメージを用いた治療効果判定の定量的手法の開発）         （「論文目録（様式3）」の主論文の部分を記載する。英文の場合は和訳をつける。） For English paper, Japanese title is necessary.   （学位論文の要旨）2,000字程度、A4判  (approx.800 Words in English /A4 size)   INTRODUCTION Background:  Bioluminescence imaging (BLI) is based on the biologic process of light emission, which occurs as a result of the interaction between firefly luciferase and luciferin. Bioluminescence has often been used in the evaluation of the therapeutic effects of anticancer treatments in animals. This method allows the quantification of viable cells in tumors after treatment with various orthotopic and xenograft models in preclinical studies. The effects of cryoablation on tissues are still debated with regard to optimal parameters related to freeze-thaw cycles, including duration of freezing, repetition time, the interval between cycles, and temperature. However, as residual tumors cannot be identified immediately after cryoablation, treatment efficacy has been assessed by noting differences in tumor size and overall survival. In the present study, BLI was used as a quantitative imaging biomarker in the early stage after cryoablation. Purpose:  博士課程用（甲）  To employ BLI as a quantitative imaging biomarker to assess preclinical evaluation of cryoablation in a murine model.  MATERIALS AND METHODS In vitro study:  Colon26-Luc (C26-Luc) cells were seeded at 6 different concentrations in 35-mm dishes. These were divided into 6 groups: group 0 (G0), a control group without treatment; and groups 1–5 (G1–G5) according to the number of freeze–thaw cycles, with each cycle consisting of freezing at -80ºC for 10 min followed by thawing at room temperature for 5 minutes. BLI and flow-cytometric analysis were performed after cryotherapy. Flow-cytometric analysis was performed to detect the viability of the cells after the same experiments as cryotherapy. In vivo study:  20 tumor-bearing mice with C26-Luc cells were divided into 4 groups: group 0 (G0), a control group; and groups 1-3 (G1-G3) according to the number of freeze-thaw cycles. Each cryoablation procedure was performed for 30 seconds with liquid nitrogen (-170ºC) applied with cotton-tipped applicators. BLI was acquired at 6 hours and 1, 3, and 7 days after treatments. Tumor sizes were measured by a caliper every 2-3 days until the study endpoint. Tumor volume was calculated by using the following formula: tumor volume = 1/2 x (length x width2).  RESULTS In vitro study:  BLI signal showed a negative correlation with the number of freeze-thaw cycles (r = –0.86, p = 0.02). Viable cell numbers enumerated by flow cytometry gradually decreased with the number of freeze-thaw cycles (r = -0.91, p < 0.0001). One freeze-thaw cycle resulted in the death of 74.8% ± 2.1 of the total cells, and there was no significant difference among the numbers of viable cells after 3, 4, and 5 cycles. There was a highly linear correlation between viable cell number determined by flow cytometry and BLI signal (r = 0.88, p < 0.0001).   In vivo study:  博士課程用（甲）  There was no difference in tumor volume at 1 day after cryoablation among all groups, but the BLI signals were significantly different between G0 and G2/G3 (p = 0.03 and p = 0.02, respectively) and between G1 and G3 (p = 0.04). Also, the BLI signals of G0 were significantly higher than those of all treatment groups (P values range from < 0.05 to 0.0001 in G1-G3) from 1 day and 3 days after treatment except for G1 at 1 day after treatment (p = 0.06).  The mean survival times of the mice were 6.8 days ± 1.5 in G0, 11.5 days ± 2.3 in G1, 19.0 days ± 6.8 in G2, and 21.3 days ± 3.5 in G3. At 45 days after cryoablation, only 2 of 5 mice in G3 (40%) remained alive. Kaplan–Meier analyses with the log-rank test revealed that survival times were significantly different (p < 0.0001).   CONCLUSION BLI successfully demonstrated viable tumor cells immediately after cryoablation in vitro and in vivo. This method allows the evaluation of early treatment response to cryoablation at 1 day after treatment, making it a feasible approach for tumor monitoring in preclinical models. 【背景】 Bioluminescence（発光）は、ルシフェリン基質とルシフェラーゼ酵素の反応から光を発する蛍の原理を用いている。この技術を用いると、抗がん剤などの細胞への作用を検討する際に、ルシフェラーゼ遺伝子が導入されている癌細胞の発光を測定することによって、定量的に生存している細胞数などを定量的に観察する事ができる。 凍結療法はすでに腎細胞癌に保険適応されており、国内でも10数カ所で治療が行われているが、凍結―溶解サイクルの最適な条件等については議論の余地がある。凍結療法後比較的短時間のうちに癌細胞が生存しているかどうかを評価する簡便な方法が存在しないことが適切な治療条件の検討を困難にしている。 【目的】 担癌マウスに凍結療法を行い、その治療効果を発光イメージング（Bioluminescence imaging; BLI)で定量的に評価ができるかどうか検討した。 【対象と方法】 ・In vitro: 用いた細胞はColon26-Luc(C26-Luc)であり、これはマウス大腸癌にルシフェラーゼ遺伝子導入した細胞である。C26-Lucを播種した35mm培養皿を用意し、10分間の-80℃凍結と室温による5分間の解凍の繰り返しの回数により、グループ0（0回。コントロール）からグループ5（5回繰り返す）に分類し、BLIによる発光能の計測とフローサイトメトリーによる死活細胞のカウントを行った。 ・In vivo: 20匹のC26-Lucを皮下移植した担癌マウスを作成し、凍結療法の凍結-解博士課程用（甲）  凍サイクルをそれぞれ0回（コントロール）、1、2、3回行った群をG0、G1、G2、G3とした（各群：n=5）。凍結療法は、液体窒素を用いた綿棒を皮下腫瘍に密着させるtouch method（30秒間凍結・1分自然解凍）を用いた。BLIは、治療後6時間後1日、3日、7日後に行なった。腫瘍サイズは、ノギスにて2-3日間隔で計測した。 【結果】  ・In vitro: 発光シグナルと凍結-解凍サイクルの回数に負の相関が認められた（r = –0.86, p = 0.02）。フローサイトメトリーによる生細胞数にも凍結-解凍サイクルの回数による負の相関が認められた（r = -0.91, p < 0.0001）。発光強度とフローサイトメトリーによる生細胞数には高い相関が認められた（r = 0.88, p < 0.0001）。 ・In vivo: 腫瘍サイズは治療後1日では変化が認められなかったが、すべての治療群で、G1、G2、G3のいずれにおいてもGOと比較して発光シグナルの著明な低下が認められた。 【結語】  BLIは凍結治療における腫瘍壊死を細胞レベルでも個体レベルでも早期の段階で評価できることが分かった。本法は、前臨床レベルで凍結治療の評価を行うことに利用ができると考えられる。     

Bioluminescence Image as a Quantitative Imaging Biomarker for Preclinical Evaluation of Cryoablation in a Murine Model

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Bioluminescence Image as a Quantitative Imaging Biomarker for Preclinical Evaluation of Cryoablation in a Murine Model

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