Hanaoka, Hirofumi

Kameo, Satomi

Kartamihardj, A.Adhipatria P.

Koyama, Hiroshi

Tsushima, Yoshito

English

Institutional Repositories DataBase (IRDB)

Quantitative Analysis of Different Chemical Structures of Retained Gadolinium in the Brain of Mouse

Gunma University Academic Information Repository

25．脳微小血管内皮細胞由来の細胞外小胞表面に存在するフィブロネクチンはオリゴデンドロサイト前駆細胞への小胞取り込みに関与する大澤 祥??，倉知 正?，山本 華子?好本 裕平?，石崎 泰樹?（１ 群馬大院・医・脳神経外科学）（２ 群馬大院・医・分子細胞生物学）【背景と目的】 我々はこれまでに大脳深部白質梗塞に脳微小血管内皮細胞(MVEC;microvascular endothelial cel)を移植することによりオリゴデンドロサイト前駆細胞(OPC;oligodendrocyte precursor cel)が増加し,梗塞巣の縮小と運動機能が改善することを報告した.また,MVEC由来の細胞外小胞 (EV;extracelular vesicle)がin vitroでOPCの生存・増殖を促進させることを報告した.今回,我々はMVEC由来のEV(MVEC-EV)がOPCの生存・増殖に寄与する分子メカニズムを,タンパク質に着目して解析した.【材料と方法】 MVECは成体 (生後8週齢)ラットの大脳皮質より分離した.OPCは生後2日齢のラット大脳皮質からimmunopanning法により調製した.EVはMVEC培養上清よりエクソソーム分離試薬を用いて調製した.【結 果】 タンパク質質量分析およびELISAによる解析から,MVEC-EV表面にフィブロネクチン (FN)が豊富に存在することが明らかになった.FNはインテグリンを介したシグナル経路によりOPCの生存・増殖を促進することが知られているが,培養OPCにRGDペプチドを添加してもOPC に対するEVの効果に変化は認められなかった.近年,標的細胞におけるEVの取り込みにFNとともにヘパラン硫酸プロテオグリカン (HSPG)が関与している可能性が示唆されている.フローサイトメトリーおよびイメージ解析の結果,EV表面のFNとOPC表面のHSPGとの結合を阻害することでOPCによるEVの取り込みが減少し,OPCの生存・増殖促進効果が減弱することが明らかとなった.【考察と結語】 MVEC-EV表面のFNはOPCへのEVの取り込みに関与し,インテグリンシグナル経路と独立してOPCの生存・増殖に寄与していると考えらえる.26．アデノ随伴ウイルスベクターを用いた神経細胞特異的ＮＳＥプロモーターの解析篠原洋一郎??，今野 歩?，大谷 理了?平井 宏和?（１ 群馬大院・医・脳神経再生医学）（２ 群馬大院・医・眼科学）【背景と目的】 Neuron-specific enolase(NSE)は神経細胞で特異的に発現している解糖系酵素であり,NSE遺伝子上流1.8 kbは神経細胞特異的にプロモーター活性をもつことが知られている.ウイルスベクターとNSEプロモーターを組み合わせることで神経細胞特異的な遺伝子発現が可能になる.しかし,1.8 kbの領域のどこがニューロン特異性を決めているのか,どこがプロモーター活性に重要なのかはよくわかっていない.今回我々はアデノ随伴ウイルスベクター血清型9型(AAV9)ベクターを用いて,NSEプロモーターにおけるプロモーター活性および神経細胞特異性を調節している領域を検討したので報告する.【材料と方法】 ラットゲノム由来の1.8 kb NSEプロモーターを5?末端よりA(0.8 kb),B(0.7 kb),C(0.3 kb)の領域に分類し,さらにその下流にあるイントロン1のD領域 (0.5 kb)を含めて様々な長さのNSEプロモーターを作成した.このNSEプロモーター制御下で緑色蛍光タンパク質 (GFP)を発現するAAV9ベクターを作成し,4-5週齢の野生型マウスの小脳に直接投与して3週間後に観察した.【結 果】オリジナルの1.8 kb(ABC)プロモーターからA領域を除いた1.0 kb(BC)プロモーターはオリジナルの6.2％のプロモーター活性であった.さらにB領域を除いた0.3 kb(C)プロモーターは1.0 kb(BC)プロモーターと同程度の活性であった.そこで1.8 kb(ABC)プロモーターからB領域を除いた1.1 kb(AC)プロモーターを検討したところ,活性は約5.7％に減少した.D領域はプロモーター活性に影響がなかった.免疫染色では1.8 kb(ABC)プロモーターはプルキンエ細胞と介在ニューロンにGFPが発現していた.1.8 kb(ABC)プロモーターからA領域,あるいはB領域を欠損させるとほとんどの小脳領域でプルキンエ細胞へのGFP発現が消失した.一方,介在ニューロンへのGFP発現は変わらなかった.【考察と結語】 NSEプロモーターにおいてC領域は介在ニューロンへの発現を支配しているシス作用領域を含んでいると考えられる.また,C領域にA領域およびB領域の両方を加えることでプルキンエ細胞への発現が劇的に上昇しており,A領域とB領域は相乗的にプルキンエ細胞への発現に関与していることが示唆された.27．Quantitative Analysis of Different Chemical Struc-tures of Retained Gadolinium in the Brain of Mouse A.Adhipatria P.Kartamihardja?,Hirofumi Hanaoka?,Satomi Kameo?,Hiroshi Koyama?and Yoshito Tsushima?（１ Department of Diagnostic Radiology and Nuclear Medicine,Gunma Univer-sity Graduate School of Medicine）（２ Department of Public Health,Gunma University Graduate School of Medi-cine）【Background& Objective】 Gadolinium-based contrast agents(GBCAs)are particularly useful for detecting aggres-sive or metastatic brain tumors and vascular lesions.However,recent studies demonstrated that the use of GBCAs,especialy linear type,resulting in retained gadolinium (Gd)in various organs,including the brain.― ―273Therefore,we investigated the chemical structure of the retained Gd in various parts of the brain after intravenously administering a single dose of GBCAs in normal mouse.【Methods】 A single dose of clinicaly available GBCAs(Gd-DTPA,5 mmol/kg or Gd-DO3A,5 mmol/kg)were intravenously administered to five mice of each treated group.5 mL/kg of saline was intravenously administered to mice of the control groups.Ten days later,samples of the dissected parts of the brain were obtained.Protein extrac-tion reagent were added and further separation was done by chromatogram based on molecular size.Gd concentrations in each sample were quantified using mass spectrometry.【Results】 After ten days,the residual Gd were found in many forms in both Gd-DTPA and Gd-DO3A group.Some residual Gd were likely in intact form of the adminis-tered Gd,while others were bound to diferent size of proteins.Total Gd concentration of Gd-DTPA and Gd-DO3A were similar.The trace of intact GBCAs was found mostly in the meninges.The exact complex and the Gd concentration from the pelet were not determined.【Conclusion】 The retained Gd found in the mouse brain after a single dose administration of diferent type of GBCAs was observed in many forms,including the intact GBCAs.The intact form of GBCA may be slowly eliminat-ed through the meninges and the glymphatic system while the other form may retained longer depend on the chemical structures.Thus,the chemical structure of the retained Gd are crucial for the elimination process of Gd from the brain.28．全身性強皮症に伴うレイノー現象・手指潰瘍に対するＢ型ボツリヌス毒素局所注入療法の効果・安全性について：ランダム化容量比較試験による検討関口 明子?，茂木精一郎?，上原 顕仁?藤原千紗子?，伊達 佑生?，中村 哲也?石川 治?（１ 群馬大院・医・皮膚科学）（２ 群馬大医・附属病院・臨床試験部）【背景と目的】 全身性強皮症は指定難病であり,皮膚および内臓の線維化,血管障害を特徴とする.レイノー現象は,ほとんどの患者で生じ,指の小動脈の虚血再還流による色調変化と疼痛,痺れを来しQOLの低下をもたらす.手指の虚血が持続すると皮膚潰瘍に至る.我々は,レイノー現象を有する強皮症日本人患者に対してA型ボツリヌス毒素を注入し,本邦で初めて安全性や有効性を確認した (J Der-matol 2016;43:56-62.).しかし,これまでにB型毒素の効果を検討した報告はない.そこで本研究では,強皮症に伴うレイノー現象・手指潰瘍に対するB型ボツリヌス毒素の効果と安全性を検討することを目的とした.【材料と方法】45人の患者を無投与群とB型ボツリヌス毒素を片手全体で250 1,000 2,000単位注入する群の4群にランダム化割り付けした (無作為化単盲検試験).レイノースコア,痛み・痺れ (VASスケール),冷水負荷試験にて,治療開始前と 4,8,12,16週間後に評価した.【結 果】 レイノー症状の重症度と痛み・痺れは,1,000 2,000単位群において,無投与群,250単位群と比較して,投与4週間後に有意に改善し,投与12週間後まで持続した効果が得られた.冷水負荷後の皮膚温度の回復度も2,000単位群において有意に上昇した.手指潰瘍数も1,000 2,000単位群にて,無投与群,250単位と比較して有意な低下がみられた.軽度の筋力低下が1例みられたが重大な副作用はみられなかった.【考察と結語】 世界で初めてB型ボツリヌス毒素の安全性,有効性を示す結果を得た.特徴として,1回の注射で3～4か月間の効果が期待できることが挙げられる.また,既存の治療とは異なる治療機序であり,既存の治療では難治な症例に対する治療効果が期待される.現在,本邦では,B型ボツリヌス毒素は痙性斜頸の治療に保険適応があるが,今後,詳細な臨床研究の蓄積によって適応拡大が望まれる.29．全身性強皮症の線維化における分泌蛋白質MFG-E8の病態的意義の解明藤原千紗子，茂木精一郎，上原 顕仁横山 洋子，関口 明子，荻野 幸子鳥居 良子，細井 真理，石川 治（群馬大院・医・皮膚科学）【背景と目的】 分泌蛋白質MFG-E8はRGD配列を介してインテグリンαVβ3/5と結合して,アポトーシス細胞の貪食促進作用や血管新生能を示す.本研究では,TGF-βシグナルにおけるMFG-E8の役割と全身性強皮症の線維化における病態的意義を解明することを目的とした.【材料と方法】 強皮症患者由来線維芽細胞を用いて,rMFG-E8や変異MFG-E8蛋白処理によるTGF-βシグナルへの影響を検討した.強皮症モデルマウスであるブレオマイシン誘導線維化マウスとtight-skinマウスを用いて,in vivoの線維化に対するMFG-E8の役割を検討した.【結 果】強皮症由来線維芽細胞において,rMFG-E8処理によって潜在型TGF-β刺激によるI型コラーゲン,CTGF,αSMAの発現亢進やSmad2のリン酸化が抑制されることを見出した.さらに,RGDをRGEに変異させたMFG-E8の処理では,潜在型TGF-β刺激によるI型コラーゲン等の発現亢進は抑制されなかった.これらの結果より,MFG-E8がインテグリンとの結合を介して潜在型TGF-β刺激による線維化を抑制することが示唆された.MFG-E8 KOマウスではブレオマイシン投与による皮膚と肺の線維化が亢進していた.また,tight-skin/MFG-E8 KOマウスでは,tight-skin/MFG-E8 WTマウスと比較して皮膚と肺の線維化が亢進していた.強皮症患者と健常人の皮膚におけるMFG-E8の発現を比較したところ,強皮症皮膚では血管周囲のMFG-E8の発現が低下しており,また血清MFG-E8量も― ―274第64回北関東医学会総会

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