Shintoku, Ryosuke

シントク, リョウスケ

神徳, 亮介

English

Gunma University Academic Information Repository

博士課程用（甲）  - 1 - （様式4）  学 位 論 文 の 内 容 の 要 旨  （  神 徳 亮 介  ）  印  （学位論文のタイトル） Lipoxygenase-mediated generation of lipid peroxides enhances ferroptosis induced by erastin and RSL3 （リポキシゲナーゼによる過酸化脂質の生成がフェロトーシス感受性に影響を与える）   （学位論文の要旨） 【研究目的とその背景】        脳虚血による神経細胞障害ではアポトーシスのみならずネクローシス様の細胞死形態が観察される。近年見出されたフェロトーシスは、RASがん細胞に有効な抗腫瘍化合物（FINと総称）が誘起する鉄依存性のネクローシス様細胞死で、活性酸素種（Reactive oxygen species: ROS）の増加と過酸化脂質(Lipid-ROS)の蓄積を特徴としている。最近、FINの標的分子として酸化脂質還元酵素グルタチオン・ペルオキシダーゼ4(GPX4)が同定され、この酵素の機能不全は腎上皮の虚血性細胞死を引き起こすことが報告された。脂質過酸化を防止する抗酸化剤は、虚血時に神経細胞を保護することが示されており、我々もオートファジー・リソソーム阻害剤が虚血性神経細胞死およびがん細胞のフェロトーシスの双方を抑制することを報告した。従ってフェロトーシスは虚血性細胞死の基盤である可能性が考えられる。 フェロトーシスでは、グルタチオン濃度の低下等によりGPX4の働きが阻害されると、Lipid-ROSが広がり細胞死に至ることが示されている。一方でLipid-ROSの生成や拡大機序、細胞死実行の具体的な仕組みは解明されていない。一般に、生体膜の脂質過酸化は化学的なフリーラジカル連鎖反応により進むと考えられるが、酸化酵素リポキシゲナーゼ(LOX)の一部にはエステル化した脂質に対する活性が報告されるため、その関与が推察される。LOXはアラキドン酸などの多価不飽和脂肪酸（PUFA）の酸化を触媒する非ヘム鉄酵素である。本研究では、変異RASがん細胞株を用いてFINに誘導されるフェロトーシスを解析し、LOX分子種および生成産物のフェロトーシスへの関わりを明らかにすることを目的とした。 【材料と方法】 1. 細胞培養とフェロトーシスの誘導 HT1080(ヒト繊維肉腫細胞)、Panc-1(ヒト膵臓がん細胞)はウシ胎児血清(10％)を加えたDMEMで、Calu-1(ヒト非小細胞がん細胞)はEMEMで培養した。フェロトーシスの誘導はErastinまたはRSL3を加えた培地で処理し、細胞の生死はトリパンブルー染色により判定、細胞死率を算出した。 2. LOX阻害剤および活性化化合物 ALOX15特異的な阻害剤としてPD146176、ALOX12/15阻害剤としてBaicaleinを用いた。またALOX15活性剤として(E)-1-(7-benzylidene-3-phenyl-3,3a,4,5,6,7-hexahydroindazol-2-yl)-2-(4-methylpiperazin-1yl)ethanoneを合成し、これを用いた。 博士課程用（甲）  - 2 - 3. LOX遺伝子のクローニング HT1080細胞由来cDNAを鋳型としてALOX15-1遺伝子をPCRで増幅し、mRFPを有するベクターにサブクローニングした。 4. ALOX15のノックダウン ALOX15-1遺伝子に特異的なsiRNAを合成し、これを細胞にトランスフェクションした。  【結果と考察】  RSL3でHT1080にフェロトーシスを誘導したとき、処理後3時間でLipid-ROSが観察された。蛍光抗体染色法を用いてω6-PUFAのアルデヒド産物である4-ヒドロキシ-2-ノネナール(4-HNE)の蓄積を解析したところ、同様に3時間後からシグナルの増強がみられた。また脂質膜酸化阻害剤のTroloxは、RSL3添加3時間後の投入では細胞死を抑制したが、4時間後では抑制できなかった。これらの結果から、フェロトーシスにPUFAの代謝が関わっており、4-HNEが細胞全体へ蓄積することで細胞死が不可逆となることが分かった。 フェロトーシス中のLOX蛋白質の挙動をイムノブロットおよび蛍光染色で解析した。HT1080細胞においてALOX12の発現レベルは低いが、FINの処理により増加傾向があり、フェロトーシス後期の蛋白質分解段階でも安定して存在していた。一方、ALOX15は高レベルで発現し、多くが形質膜やオルガネラ膜上に局在していた。そこでALOX15に注目し、siRNAを用いて発現阻害効果を解析した。ALOX15をノックダウンさせたHT1080やCalu-1では、FINによるフェロトーシスが有意に抑制された。 次にLOXの発現プラスミドを作成し、ALOX15を過剰発現させた。一部の過剰発現細胞はFIN処理なしで細胞死が観察され、またALOX15発現細胞は低濃度のFINに対して感受性が高まることを確認した。LOXは膜局在に関わるN末側と触媒領域を持つC末側というドメイン構造を有するが、ALOX15のN末端欠失変異体(ΔN)はFIN感受性増加の活性を示さなかった。したがってALOX15は、脂質膜への局在化によりフェロトーシス感受性に影響を及ぼすことが示された。またALOX15に特異的な活性化剤を合成し使用したところ、活性化剤単独ではフェロトーシスを誘導しなかったが、調べた３種のがん細胞でFIN感受性が有意に向上した。 【結論】 脂質膜上のALOX15が触媒するPUFAの酸化がフェロトーシスの実行に重要であり、内在性の リポキシゲナーゼ活性が癌細胞のFIN感受性に深く関わっている。 

Lipoxygenase-mediated generation of lipid peroxides enhances ferroptosis induced by erastin and RSL3

https://gair.media.gunma-u.ac.jp/dspace/bitstream/10087/12183/2/m-k1655-1.pdf

Lipoxygenase-mediated generation of lipid peroxides enhances ferroptosis induced by erastin and RSL3

Abstract

Similar works

Full text

Available Versions

Gunma University Academic Information Repository