Changes in gene expression of the biosynthesis pathway of steviol glycosides and in the content of bioactive compounds induced by elicitors in Stevia rebaudiana Bertoni (Asteraceae)

Abstract

Currently, there is a global demand for additional sources of natural sweeteners and antioxidant compounds. Stevia rebaudiana plants, besides having steviol glycosides (SGs) sweeteners, also present a large amount of phenolic compounds. Therefore, the present study is focused on the elicitor action of four growth regulators, methyl jasmonate (MeJa), spermidine (SPD), salicylic acid (AS) and paclobutrazol (PBZ) and different concentrations of NaCl in the content of SGs (stevioside and rebaudioside A) and phenolic compounds, as well as on the total antioxidant capacity and level of expression of the genes involved in the three stages of the SGs biosynthesis pathway in S. rebaudiana. For this, four studies were carried out, the first of which was aimed at evaluating the stability of the expression of seven candidate genes for normalizers (18S ribosomal RNA, Actin, Aquaporin, Calmodulin, Eukaryote elongation factor 1-α, Malate dehydrogenase, and Ubiquitin) in gene expression studies for the later use. Initially the stevia plants were cultivated in vitro and later passed to a hydroponic continuous flow system with floating roots. The treatments were composed by the control, only with Hoagland solution (50%) and the others containing the same solution added with 100 μM MeJa, SPD and SA. After 24 h of application of the treatments, the leaves of these plants were collected in a period of five days. The results indicated that the Ubiquitin and Actin genes can be used to normalize the gene expression data in Stevia rebaudiana, since both genes presented high stability. The second study aimed at evaluating the effect of MeJa, SPD, SA and PBZ on the expression levels of genes related to SGs biosynthesis and also on the content of stevioside and rebaudioside A. The experimental conditions were the same as in the first study except the treatment with PBZ, which in this study constituted another treatment. The results provided direct evidence that MeJa and SPD treatments resulted in increased transcription of genes related to SGs biosynthesis, whereas PBZ caused a decrease in expression, especially in those genes encoding caurenoid enzymes (GGDPS, CDPS, KS , KO). Treatment with SA did not affect the transcription of UGT85C2, UGT74G1 and UGT76G1 genes and caused a decrease in stevioside levels. The third study aimed to evaluate if any of the elicitor compounds (MeJa, SPD, SA or PBZ) were able to increase the content of phenolic compounds and the antioxidant capacity of stevia plants. The experimental conditions were the same as in the second study. Our results showed that exposure to MeJa provided higher production of total soluble phenolic compounds, carotenoids and in addition an improved antioxidant activity. On the other hand, the addition of SPD, SA and PBZ showed no significant increase in any of the evaluated parameters. The fourth and last experiment was carried out in vitro and had the objective of evaluating the effect of different concentrations of NaCl on growth parameters, total soluble sugars, SGs and phenolic compounds, as well as on the antioxidant capacity and level of expression of the genes involved in biosynthesis of SGs in S. rebaudiana. To meet this objective, stevia plants were initially cultured in vitro in MS medium (50%) with different concentrations of NaCl. The results showed that the higher concentrations of NaCl decreased some growth parameters (number of roots, dry and fresh mass) while there was an increase in the antioxidant capacity (FRAP test), hydroxycinnamic acids and total soluble sugars. In addition, several genes encoding important enzymes (CMS, CMK, HDR and UGT76G1) from the SGs biosynthetic pathway were positively regulated after NaCl treatments. The results of the four studies allowed new insights into the mechanisms of physiological, biochemical and molecular responses of stevia plants after the application of different elicitors and opened new avenues to be explored that ensure the good use of these natural sources of compounds as well as the survival and sustainability of this species.Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPESAtualmente, existe uma demanda global por fontes adicionais de edulcorantes naturais e compostos antioxidantes e as plantas de Stevia rebaudiana, além de possuirem edulcorantes, chamados de glicosídeos de esteviol (GSs) também apresentam grande quantidade de compostos fenólicos. Diante disso, o presente estudo centrou-se em explorar a ação elicitora de quatro reguladores de crescimento, metil jasmonato (MeJa), espermidina (SPD), ácido salicílico (AS) e paclobutrazol (PBZ) e de diferentes concentrações de NaCl no conteúdo dos GSs (esteviosídeo e rebaudiosídeo A) e compostos fenólicos, bem como, sobre a capacidade antioxidante total e nível de expressão dos genes envolvidos nos três estágios da via de biossíntese dos GSs em S. rebaudiana. Para isso, foram realizados quatro estudos, sendo que o primeiro teve por objetivo avaliar a estabilidade da expressão de sete genes candidatos a normalizadores (18S, Actina, Aquaporina, Calmodulina, Fator de Alongamento-1a, Malato desidrogenase e Ubiquitina) para posteriormente serem usados em estudos de expressão gênica. Inicialmente as plantas de estevia foram cultivadas in vitro e posteriormente passaram para um sistema hidropônico de fluxo contínuo com raízes flutuantes. Os tratamentos foram compostos pelo controle, somente com solução de Hoagland (50%) e os demais contendo a mesma solução adicionados de 100 μM de MeJa, SPD e AS. Após 24 h da aplicação dos tratamentos, as folhas destas plantas foram coletadas em um período de cinco dias. Os resultados indicaram que os genes Ubiquitina e Actina podem ser usados para normalizar os dados de expressão gênica em Stevia rebaudiana, pois ambos os genes apresentaram alta estabilidade. O segundo estudo visou avaliar o efeito de MeJa, SPD, AS e PBZ sobre os níveis de expressão dos genes relacionados à biossíntese dos GSs e também sobre o conteúdo de esteviosídeo e rebaudiosídeo A. As condições experimentais foram as mesmas do primeiro estudo, exceto o tratamento com PBZ, que neste estudo constituiu mais um tratamento. Os resultados forneceram evidências diretas de que os tratamentos com MeJa e SPD resultaram em aumento na transcrição dos genes relacionados à biossíntese dos GSs, enquanto que o PBZ causou uma diminuição na expressão, principalmente naqueles genes que codificam as enzimas caurenoides (GGDPS, CDPS, KS, KO). O tratamento com AS não afetou a transcrição dos genes UGT85C2, UGT74G1 e UGT76G1 e causou uma diminuição nos níveis de esteviosídeo. O terceiro estudo teve por objetivo avaliar se algum dos compostos elicitores (MeJa, SPD, AS ou PBZ) eram capazes de aumentar o conteúdo de compostos fenólicos e a capacidade antioxidante das plantas de estevia. As condições experimentais foram as mesmas do segundo estudo. Nossos resultados mostraram que a exposição ao MeJa propiciou maior produção de compostos fenólicos solúveis totais, carotenoides e adicionalmente uma atividade antioxidante aprimorada. Por outro lado, a adição de SPD, AS e PBZ não mostrou aumento significativo em nenhum dos parâmetros avaliados. O quarto e último experimento foi realizado in vitro e teve como objetivo avaliar o efeito de diferentes concentrações de NaCl nos parâmetros de crescimento, açúcares solúveis totais, GSs e compostos fenólicos, bem como, na capacidade antioxidante e no nível de expressão dos genes envolvidos na biossíntese dos GSs em S. rebaudiana. Para atender este objetivo plantas de estevia foram inicialmente cultivadas in vitro em meio MS (50%) com diferentes concentrações de NaCl. Os resultados mostraram que as maiores concentrações de NaCl diminuíram alguns parâmetros de crescimento (número de raízes, massa seca e fresca) enquanto aumentaram a capacidade antioxidante (ensaio FRAP), ácidos hidroxicinâmicos e teor de açúcares solúveis totais. Além disso, vários genes que codificam importantes enzimas (CMS, CMK, HDR e UGT76G1) da via biossintética dos GSs foram regulados positivamente após o tratamentos com NaCl. Os resultados dos quatro estudos permitiram novos insights sobre os mecanismos de respostas fisiológicas, bioquímicas e moleculares das plantas de estevia após a aplicação de diferentes elicitores e abriu novos caminhos a serem explorados que assegurem o bom uso dessas fontes naturais de compostos, bem como a sobrevivência e sustentabilidade desta espécie