早大学位記番号:新7275早稲田大

Itoh Hideki

早稲田大学博士(理学)早大学位記番号:新7275doctoral thesi

伊藤, 秀城

57746

Itoh, Hideki

Waseda University Repository

早稲田大学大学院先進理工学研究科博士論文審査報告書論文題目Microspic Thermotry and Tempratu Efects on Celular Functions 申請者Hidek ITOH 伊藤 秀城物理学及応用物理学専攻実験生物物理学研究2016 年 3 月動物、とくに恒温動物は、体温を維持するために、常に熱を発生している。骨格筋は力発生装置であり、運動に必須の臓器だが、同時に熱発生装置でもある。運動するためには力学的な仕事をする必要があり、そのために化学的エネルギーを 消 費 す る 結 果 、 必 然的に熱が発生する。さらに筋組織内では、生体にとってのエネルギ一通貨であるアデノシン三リン酸（ ATP ）がミトコンドリアで合成されるが、その際に熱が産生される。このような基礎代謝は、運動性の臓器でなくても、あらゆる細胞で行われ、熱が産生されている。脳組織はその活動に応じて熱を産生し、脳組織の部位ごとの温度も異なることが知られており 、 長 年 に 亘 っ て 生理学的な研究が行われてきた。では、組織を構成する細胞レベルでの熱産生はどのようになっているだろう か。熱産生の時空間的なダイナミ ク ス は ど の よ う な も の か 。 細 胞 内 の 温度分 布 は 一 様 だろうか。時間的な変動はどのようなものだろうか。そして、それらは、その細胞の機能発現と何ら か の か か わ り を 持 っ て い る だ ろ う か 。近年、新規の顕 微解析法による 1 細胞レベルでの熱産生のミクロ計測が盛んに行われるようになった。それと同時に、ミクロな熱パルスを与えることによる細胞機能の応答性の研究も進んでいる。特に注目されるのは、特定の細胞内小器官（オルガネラ）に特異的 に結合するナノ温度計が開発され、細胞 機能の発現に伴うミトコンドリアなどの熱発生（温度上昇）が蛍光イメージングされていることである。本研究 は、これらの先行研究を土台として、蛍 光強度や蛍光寿命の温度特性を顕微解析することで、 1 細胞レベルでの温度分布や、化学刺激に対する発熱反応、それにレーザ一光を用いた熱パルスに対する Ca2 ＋応答性などを、蛍光性の温度感受性シートや、同グループによって開発された細胞内小器官に特異的に結合する蛍光色素などを用いて細胞温度を顕微計測し、 1 細胞熱力学の発展に寄与することを目指したものである。第 1 章は本研究の序論である。本研究の目的が、細胞機能への温度の効果、とくに熱パル ス の 作 用 を l 細胞レベルで調べることと、機能発現に伴う細胞温 度 の 微 小 な変化を顕微鏡下でイメージングし、新しい現象を発見するという、細胞生物物理学における新領域の開拓にあることが述べられている。第 2 章では、光学顕微鏡下での 温度計測に関する新しい方法が述べられ ている。近年、 1 細胞レベルや細胞内における温度分布を顕微計測するための様々な技術が開発されているが、 2 次元の温度分布を一度に画像化する方 法は報告されていなかった。そこで申請者は、温度感受性の蛍光シートを開発した。蛍光シートは、カバーガラスの表面に蛍光物質を混ぜた高分子ポリマーを、スピンコートしたものである。 Europium (I) thenoyltrifluor-acetonate trihydrate(Eu-TA ）と rhodamine B(RB ）の 2 種類が蛍光物質として検討された。Eu-TTA シートが 25°C 基準で－2. 8 %／。 C の感受性を示したのに対して、 RB シートは－ 1.8 %／。 C と、感受性が低かった。そこで本研究では E u-TTA シートを用いることにした。一方、 145 nm の近赤外レーザ一光を対物レンズで絞り、水に吸収させることで顕微鏡下に点熱源を形成した。この手法によって、 2次元的な同心円状の温度分布が形成 さ れ る こ と を Eu-TT A シートの蛍光イメージングによって確認した。この手 法 は 、 レ ー ザ 一 光 を 短 時 間 照 射 す る ことで、熱パルス法として活用された。さらに、蛍光物質濃度（蛍光強度）などに依存しない蛍光温度計測法として、蛍光寿命測定法（ FLIM ）を採用した。用いた蛍光物質 ER thermo yelow は（筋）小胞体（ Sarco/endoplasmic reticulum: SR/ER ）に局在し、蛍光寿命は 2 つの成分からなり、 He La 細胞 中 で は 、 蛍 光 強 度 で 重 み 付 け し た 平 均 蛍光寿命は、 25 ℃で 2. 5 0 ns 、 37 ℃で 2.8 ns で あ っ た 。 こ の 平 均 蛍 光 寿 命 の 温度依存性は 23 ℃と 40 ℃の問で線形性を示し、その傾きは－ 26 psi 。C であった。この温度特性は C2Cl2 の筋芽細胞（ myoblast ）と筋管細胞（ myotube ）においてもほぼ同様であった c また、細胞質内の温度分布をイメージングするために、蛍光性タンパク質 mCherry を筋管細胞の細胞質内に発現させて、蛍光寿命の温度特性を調べたところ、 24 ℃と 40 ℃の問でー 14 ps/°C が得られた。これらの結果は、第 3 章の研究に応用された。第 3 章では、特定の細胞内小器官近傍の温度変化に着目した。まず、 He La 細胞をイオノマイシン（ Ca2 ＋イオノフォア）処理すると温度上昇がみられるという先行研究の結果を、 ER thermo yelow によって調べ、温度上昇が 0.93 士0.68°C （平均士標準偏差）であることを確認した。次に、骨格筋細胞の温度変化を取り上げた。骨格筋においては震え熱発生が良く知られているが、近年、骨 格筋における非震え熱発生が熱源として機能し、その原因が SR/ER に存在する Ca2 ＋ポンプ SERCA の Ca2+ -ATPase 活性にあると報告された。そこで、骨格筋細胞にある SR 近傍での温度変化を直接検出することが試みられた。申請者は C2Cl2 筋芽（培養）細胞と、それを分化させた筋管細胞を対象に、カフェイン処理に よ っ て 誘 導 さ れ る Ca2 ＋放出に伴う熱発生の有無を調べた。まず、筋管細胞において、 ER thermo yelow の蛍光寿命は有意に短くなり、 1.6± 0.6 。C の温度上昇が捉えられた。そこで、 S ERCA の阻害剤であるタプシガルギンを作用さ せ た と こ ろ 、 熱 発生は抑制された c 従って、カフェイン処理によってリアノジン受容体（ RyR ）を介して S R から Ca2 ＋が放出されることにより、細胞質内と S R 内との Ca2 ＋濃度のアンバランスに伴う S ERCA の活性化が、熱産生を促すものと推論された。一方、筋芽細胞においては、 SR の発達が未成熟のために、カフェイン処理による Ca2+ 放出と、それに伴う細胞温 度の上昇が見られなかった。また、筋管細胞についてカフェイン処理による細胞質の温度上昇が調べられたが、 有意な変化は見られなかった。以上の結 果は、筋管細胞における温度上昇は、 S R に局所的であることを示している。第 4 章では、正常なヒト肺の繊 維芽細胞である WI-38 細胞に熱パルスを作用し、その Ca2 ＋濃度応答性を、 Ca2+ インジケータ（ fluo-4 ）を用いてイメージングした。第一に、短い熱パルス（ 2 s）の細胞応答性を調べたところ、熱パルスを切ったときに Ca2+ -burst が発生した。これは、 He La 細胞における先行研究結果に合致した。この Ca2+ -burst については、細胞外の Ca2 ＋濃度は関与せず、細胞内 の 小 胞 体 に 存 在 す る S ERCA と Ca2 ＋チャネルのイノシトール三リ ン酸受容体（ IP3R ）が関与していることが明らかとなった。第二に、熱パルスの時間を長くすると（ 150 s）、短い熱パルスのときと同様に、熱パルスを切った時に Ca2+ -burst が発生したが、 burst がピークに達するまでの時間が短かった。さ らに、熱パルスの途 中でも Ca2 ＋濃度の上昇がみられ、それに続く減衰振動が発生した。第三に、 細胞の培養温度の影響（ 25 。c と 37°C ）を、様々な大きさの熱パルス（ム T : 0。c から約 15 °C）の作用について調べたところ、 C a2+ -burst の大きさは培養温度 に よ ら ず ム T が大きくなるほど増大したが、ム T 感受 性は培養温度が高い方が高かった。ところが、最終温度（＝培養 温度＋ム T）で比較すると、 25°C の方が 37°C よ り も 、 温 度 感 受 性 が 高 かった。つまり、 Ca2+ -burst の温度感受性は、最終温度ではなく、ム T によって 決まっ て い る ことが分かった。これらの成果をもとに、申請者は熱パルスに対する Ca2+ -burst 発生の仕組みに関するモデルを提案している。第 5 章では本研究の成果を一つ一つ丁寧にまとめた上で、その成果の生理学的意味が述べられ、さらに、温度感受性シートの改良や、細胞温度計測と熱パルス法の応用、そして温度（熱パルス）による細胞機能の制御などについ ての将来展望が述べられている。以上のよう に、申請者は単一細胞の温度分布を計測する顕微鏡技術を開 発し、温度変化と細胞機能との関係を明らかにした。 WI-38 細胞への熱パル スに対する Ca2 ＋ 応 答 性 や 、 筋 管 細胞における熱発生を細胞小器官レベルで明らかにし、それらが、 S ERCA と IPaR （や RyR ）の温度特性や、細胞質と ER内の Ca2 ＋濃度のバランスの崩れによって生じることを明らかにした。一方、細胞内熱産生に伴う約 1℃の温度上昇は先行研究と同程度だったが、このような大きな温度上昇が細胞のエネルギ一代謝量をもとに説明しうるのか、現在 、 世 界 的 に議論が起こっている。本研究は、細胞内での熱発生が細胞内小器官という局所で起こっており、細胞内の温度分布は一様ではないことを 示したものであり、 1 細胞熱力学の進展に貢献するものとして、高く評価される。よって、本論文は博士（理学）の学位論文として価値あるものと認める 。2016 年 2 月審査員 主査 早稲田大学教授 理学 博 士 （ 名 古 屋 大 学 ） 石渡信一早稲田大学教授 博士（学術）（東京大学） 高野光則東京大学教授 博士（理学）（早稲田大学） 船津高志7手 7デ~ (i - あ好例lJ ゐ（〉？孝為た

Microscopic Thermometry and Temperature Effects on Cellular Functions

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顕微温度計測及び細胞機能における温度の効果

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顕微温度計測及び細胞機能における温度の効果

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