制度:新 ; 文部省報告番号:甲1888号 ; 学位の種類:博士(理学) ; 授与年月日:2004/3/15 ; 早大学位記番号:新376

岡田 令子

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制度:新 ; 文部省報告番号:甲1888号 ; 学位の種類:博士(理学) ; 授与年月日:2004/3/15 ; 早大学位記番号:新3763textthesi

Okada, Reiko

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岡田, 令子

Waseda University Repository

 早稲田大学大学院理工学研究科     博 士 論 文 概 要       論  文  題  目   両生類甲状腺刺激ホルモンの 分泌調節機構に関する研究  (Studies on regulatory mechanisms of thyroid-stimulating hormone secretion in amphibians)        申  請  者 岡田 令子 Reiko Okada  生命理工学専攻・内分泌学研究       氏  名 専攻・研究指導(課程内のみ)  1 2003 年 11 月   2 両 生 類の変 態は主として甲状腺ホルモン、副 腎 皮 質 ホルモンおよびプロラクチンにより制御されている。すなわち甲状腺ホルモンは成体器官を新たにつくり出したり幼生器官を消 滅させあるいはつくりかえることにより変 態 を進 行させる。副腎皮質ホルモンは甲 状 腺 ホルモンの作用 を強化するはたらきを示す。一 方プロラクチンは前変態期には幼生器官の発達 を促し、変態期に入ると甲 状 腺 ホルモンに拮 抗し変 態の急 激な進 行 にブレーキをかける。甲 状腺 ホルモンの分泌は脳 下 垂 体から分泌 される甲状腺刺激 ホルモン( T S H )によって制御されている。それ故 TSH は、両生類の変 態の鍵を握ると考えられる。しかしながらこれまでいくつかの研究室が両生類の TSH の単離 を試みたにもかかわらず 、純化標品が得られないか、得られてもごく少量で、放射免疫測定 ( R I A )法を確 立するには十分でなかった。そのため、このホルモンの変態期における動態も不明であり、またその放出因子の同定 も不可能であった。申請者は TSH の RIA 系の確立とTSH 分泌の制御因子の同定を目ざして研究を行った。  第１章では両生類 TSH の放出制御に関するこれまでの研 究について述べている。さらに本研究の目的について述べている。すなわち、両生類 TSH を直接的に測 定することを可 能にし、TSH 放出を制御している視床下部因子を同定すること、その反応性が幼生と成 体で異なるかどうかを明らかにすること、甲状腺ホルモンによる負のフィードバックが甲状腺 ホルモンレベルのいちじるしい上 昇が見 られる変態期にも存在するか否かを明らかにすることなどである。  第２章ではウシガエル T S H  bサブユニット(TSH b )をコードする c D N A のクローニングおよび変態期のウシガエル下垂体中での TSH b  mRNA の発現量の変動について述べている。ウシガエル下垂体前葉より抽出したトー タル RNA から作 製した c D N A ライブラリーより、シグナルペプチドと成熟した TSH bの両方をコードする cDNA をクローニングした。この c D N A 配列より推定されるアミノ酸配列は他の脊椎動物の TSH bと 40 ? 61％の相同性があること、得られたcDNA をプローブとして用いたノー ザン解析により TSH b mRNA が下垂体前葉に特異的に発現していることが確かめられたこと、以前我々の研 究 室でごく少量得 られた TSH b標 品 を用いて決定された N 末端 10 残基の配列と cDNA より推定されるアミノ酸配列が完全に一致していることから、得られた cDNA がウシガエル TSH bをコードする c D N A であることを証 明した。また変 態 期 間 のウシガエル幼 生 および 成 体 の下 垂 体 前 葉 で発 現 している TSH b mRNA をノー ザン解析により定量した。TSHb  mRNA は変態始動期でその発現量が上昇し、変態最盛期の終 盤に低 下すること、成体では発現量が極めて低いことがわかった。両 生 類の血 中 甲 状 腺 ホルモン濃 度は変 態 最 盛 期 中 盤に最 高 値に達することが知 られているが、TSH b  mRNA の変動もほぼ甲状腺 ホルモン濃度の変動と一 致するという結果が得られた。なお、TSH はaとbの二つのサブユニットが結 合した形の糖タンパク質 ホルモンであるが、aサブユニットは他の下垂体 ホルモン黄体形成 ホルモンとろ胞刺激 ホルモンと共 通であり、bサブユニットによってそれぞれのホルモンの性 質が特 徴づけられていることから、bサブユニットに的をしぼって研究を進めた。  第３章ではウシガエル TSH の RIA による測定系の確立について述べている。前章で得 られたウシガエル TSH b cDNA より推定されるアミノ酸配列のうちその C 末端 24 残基の配列 を 3持つペプチドを合 成し、ヘモシアニンをカップリングさせたものを抗 原としてウサギに投 与し抗血清 を得た。この抗血清 を用いて免疫組織化学的にウシガエル下垂体切片 を染 色したところ、ヒトTSH b抗血清が認 識する細胞と同一の細 胞が染色された。合成した TSH b  C 末端ペプチドおよび得られた抗血清を用いて、R I A による測定系を開 発した。ウシガエル幼生および成体の下垂体抽出物、血 漿、ウシガエル成体下垂体細胞培養液をいくつかの段階に希釈したものを測 定すると、標準曲線 に平 行な濃 度 依 存 的な曲 線が得られた。ウシガエルの他の下垂体 ホルモン（プロラクチン、成長 ホルモン、黄体形成ホルモン、ろ胞刺激 ホルモンおよびaサブユニット）はこの測 定 系で反 応しなかった。一 方ウシガエル下 垂 体 細 胞 培 養 液にウシガエル TSH b抗血清、ウシガエルaサブユニット抗血清 をそれぞれ別々に加えて免 疫 沈降を行 った上清中には、TSH 免疫陽性物質が含まれていなかった。このことから、下垂体細胞培養液に含まれる TSH 免疫陽性物質は、TSH bおよびaサブユニットが結合した形で存在することが確かめられた。また下垂体細胞より培養液中に放出 された TSH b免 疫 陽 性 物質はその濃度に応じてウシガエル幼生の甲状腺からのサイロキシン（T 4）分泌 を促 進することを明らかにし、この RIA により生理活性を持つウシガエル TSH の測定が可能であることを確かめた。さらにウシガエル TSH の T 4 放出促進効果は、ウシ TSH に比べて約 50 倍高いこともわかった。この R I A 系の確立により今まで不可能だった両生類 TSH の直接的な測 定を可能にした。  第 4 章では既知の視床下部因子が下垂体細胞からの TSH 放 出におよぼす効果について述べている。ウシガエル成 体および幼 生の下 垂 体 細 胞に副 腎 皮 質 刺 激 ホルモン放 出 ホルモン(CRH)、甲状腺刺激 ホルモン放 出 ホルモン(TRH)、生 殖 腺 刺 激 ホルモン放出 ホルモン(GnRH)、およびソマトスタチン( S R IH )を加えて培養し、培養液中に放 出されるTSH をR I Aにより測定した。成体下垂体細胞での TSH 放出は CRH、TRH、GnRH により促進されること、特に CRH の効果が強いことがわかった。また、CRH により引き起こされるTSH 放出は S R I Hにより抑えられることが明らかになった。一方、幼生の下垂体細胞からの TSH 分泌は CRH によって促進されるが、T R H および GnRH は効果を示さなかった。これらの結果とこれまで間接的な方 法 により調べられてきた結 果から、両 生 類 の TSH 放 出 の促 進 的な調 節はおもにCRH によりなされていることが示唆された。  第 5 章ではウシガエル視床下部抽出物が TSH 放出におよぼす効果について述べている。ウシガエル幼 生および成 体の視 床 下 部の酸抽出物を幼生 または成 体の下 垂 体 細 胞に加えて培養し、培養液中に放 出されるTSH を測定した。幼生、成 体どちらの視床下部抽出物も幼生、成体両方の下垂体細胞からの TSH 放出促進効果 を示した。幼生の視床下部抽出物の方が、成体視床下部抽出物よりもTSH 放出促進効果が強かった。これらの結果より、ウシガエル視床下部中には下垂体からの TSH 放出 を促 進する因子が含まれていることが明らかになった。第４章で述べたように CRH が強い TSH 放出活性を有していることから、視床下部抽出物中の主たるTSH 放出活性は CRH 由来のものであるかどうかをさぐるための実験を行った。すなわち CRH の拮抗物質a - he l i ca l  CRH 9 -4 1 によりどの程度放出活性が低 下するかをしらべた。その結果 a - he l i ca l  CRH9 - 4 1 により視床下部抽出物の活性がかなり低下す 4ることがわかり、視床下部に含まれるTSH 放出因子（群）による主たる活性は CRH に由来することが示唆された。  第 6 章では甲状腺ホルモンによる TSH 分泌のネガティヴフィードバックによる調節について述べている。ウシガエル幼生および成体の下垂体細胞に甲状腺ホルモントリヨー ドサイロニン( T3 )または T 4 を加えて、TSH 放出におよぼす影響を調べた。幼生では TSH の基礎的な分泌は T3 により抑制されるが、成体では効果がみられなかった。幼生と成体の下垂体細胞の反応性の違いについては、幼生と成体での細胞密度の違い、TSH 放出能の違いのいずれかまたは両者によるもので成体では基礎的分泌量が低いためと考えられた。そこで培養液にCRH を加えて TSH 放出を高めたうえで T 3 、T 4 の効果をみたところ幼生、成体のどちらの下垂体細胞でも、CRH によって引き起こされるTSH 分泌は T3 、T4 を加えることで抑制された。T4 よりもT3 の方が抑制効果は強かった。  第 7 章では本研究により得られた結論と今後の研究の進め方について述べている。すなわちウシガエル TSH 分泌は視床下部ホルモン、特に CRH により強く促進されることが明らかになった。また TSH 放出におよぼす視床下部因子の効果が幼生と成体の下垂体では異なることより、下垂体細胞が変 態により変化することが示唆された。当面の課題としては、視床下部抽出物よりTSH 放出を制御する因子（群）を単離・同定することである。 

両生類甲状腺刺激ホルモンの分泌調節機構に関する研究

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Studies on regulatory mechanisms of thyroid-stimulating hormone secretion in amphibians

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Studies on regulatory mechanisms of thyroid-stimulating hormone secretion in amphibians

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