Бєлих, Ірина Анатоліївна

Загайнова, Ю. О.

Ukrainian

eNTUKhPIIR Electronic National Technical University "Kharkiv Polytechnic Institute"; Institutional Repository

ХІІІ Міжнародна науково-практична конференція магістрантів та аспірантів  Матеріали конференції, 2019. 437 УДК УДК 60-7, 606   УДОСКОНАЛЕННЯ БІОТЕХНОЛОГІЧНОЇ СХЕМИ ВИРОБНИЦТВА РЕКОМБІНАНТНОЇ ВАКЦИНИ ДЛЯ ПРОФІЛАКТИКИ ВІРУСУ ПАПІЛОМИ ЛЮДИНИ  Ю.О. ЗАГАЙНОВА1*,  І.А. БЄЛИХ2  1магістрант кафедри біотехнології, біофізики та аналітичної хімії, НТУ «ХПІ», Харків, Україна 2доцент кафедри біотехнології, біофізики та аналітичної хімії, кандидат біологічних наук, НТУ «ХПІ», Харків, Україна *email: yul.taranenko@gmail.com  Рак шийки матки на сьогодні є однією з найбільш розповсюджених злоякісних пухлин у жінок. В Україні частота захворювання становить близько 9 тисяч випадків на 100 тисяч населення. Причиною онкологічних захворювань, зокрема раку шийки матки є вірус папіломи людини (ВПЛ) [1].  ВПЛ – це віруси, що викликають папіломи, кондиломи, дисплазію, рак шийки матки або передракові патологічні стани [1].  Зараз в Україні використовуються дві вакцини проти ВПЛ типу 16 та 18, які пройшли всі клінічні випробування і довели свою ефективність. Вважається, вакцини більш дієві, якщо вакцинація проводиться до впливу ВПЛ (найкраще до першого сексуального контакту). Ці вакцини не лікують ВПЛ або хвороби пов’язані з ВПЛ, але використовуються в профілактичних цілях і дозволяють запобігти розвитку онкологічних захворювань [1].  Вакцина для профілактики ВПЛ – рекомбінантна, виготовлена з високоочищених неінфекційних вірусоподібних часток основного білка L1 оболонки ВПЛ 16 і 18 типів. Вірусоподібні частки не містять вірусної ДНК, тому вони не можуть інфікувати клітини, але вони викликають імунну відповідь та формують клітинну імунну пам’ять[1, 2].  Метою дослідження є удосконалення біотехнологічної схеми виробництва вакцини проти ВПЛ.   Для отримання рекомбінантних білків HPV представлені приклади використання дріжджів Saccharomyces cerevsiae, які є міжнародно визнаними безпечними та здатними до вироблення великої кількості білка в нативній конформації. Проте недоліком є нестабільність рекомбінантних клітин, що пов’язана з відносно високою частотою втрат автономної плазміди при поділі клітин. Також відоме отримання рекомбінантних білків HPV з використанням рекомбінантних штамів-продуцентів білка HPV16-L1 Pichia angusta BKMY-2988D та HPV18-L1 Pichia angusta Y-2989D. Ці штами мають високу продуктивність, але не забезпечують отримання оптимального антигену. Можливе одержання вакцини проти ВПЛ з використанням дріжджів Hansenula polymorpha. Перевагою даного штаму є можливість отримання стабільно високого рівня синтезу цільового білка без порушення ефективності його ХІІІ Міжнародна науково-практична конференція магістрантів та аспірантів  Матеріали конференції, 2019 438 укладки. Використання експресійних касет з двома різними промоторами (MOX та DAK) забезпечує велику рівномірність синтезу продукту в процесі культивування [2].   Білки HPV16-L1 та білки HPV18-L1 отримують окремо, в 2 біореакторах. Отримують плазмідний вектор paM547, що містить рекомбінантний ген DAK-HPV16-L1 і селективний маркер ген LEU2 Saccharomyces cerevsiae [2]. Фрагмент ДНК DAK-HPV16 і препарат плазміди гідролізують рестриктазами BsrGl і Hindlll. Отримані препарати фрагменту ДНК з рекомбінантним геном і плазміду вносять в реакційну суміш для проведення «зшивання». Після інкубації з Т4 лігазою протягом 2 годин, 2 мкл реакційної суміші використали для трансформації штаму Escherichia coli. З декількох трансформатів виділили плазмідну ДНК. На основі рестрикційного аналізу відбирають плазміду з фрагментом DAK-HPV16[2].  Аналогічно отримують плазмідний вектор pKAM539A, що містить рекомбінантний ген MOX-HPV16-L1 і неповний ген – селективний маркер TRP3 Hansenula polymorpha [2]. Здійснюють культивування рекомбінантних клітин Hansenula polymorpha, що містять дві експресійні касети (одна з промотором МОХ, ін. – з DAK) в два етапи. На першому етапі при температурі 30°С нарощують біомассу в культуральному середовищі, що складається з 4 % дріжджового екстракту, 2 % бактопептону і 4 % гліцерину. Приблизно через 28–32 години ферментації додають індуктор до концентрації 0,5–0,8 % і підтримують на цьому рівня  48–72 години [2].  Після ферментації рекомбінантних клітин білок HPV16-L1 та білок HPV18-L1 виділяють згідно з методикою. Клітини з культуральної рідини осаджують центрифугуванням при 4000 g протягом 15 хвилин при 4°С. Для видалення основної маси нецільових білків і виділення антигену отриманий екстракт насичують сульфатом амонію до 45 % і далі осаджені білки центрифугують при 1200 g протягом 30 хвилин. Фракції, які містили антиген, концентрують ультрафільтрацією, розділяють за допомогою зонального центрифугування та очищають за допомогою гель фільтрації. Чистоту отриманого таким чином білка визначають методом електрофорезу [2].   Одним з найбільш ефективних є біотехнологічне одержання за допомогою штаму дріжджів Hansenula polymorpha. Це обмежений вид дріжджів, які використовують метанол та Карбон в якості єдиного джерела енергії [2]. Перевагами даної технології є [1]: отримання вакцини з підвищеною імуногенністю; можливість контролювати відсутність мутацій в експресованих генах; зниження енерго- та капіталовитрат [1].  Список літератури: 1. Тараненко Ю.О. Біотехнологія виробництва рекомбінантних вакцин проти вірусу папіломи людини: дипл. проект / Ю.О. Тараненко.  – Харків, 2018. –  66 с. 2. Патент RU2546243С1. Рекомбинантная вакцина для профилактики папилломавирус-ной инфекции человека и способ ее получения / М.А. Крымский, И.А. Борисов, М.С. Яковлев, М.О. Агафонов, М.Д. Тер-Аванесян. Заявл. 13.02.2014. Опубл. 10.04.2015. 

Удосконалення біотехнологічної схеми виробництва рекомбінантної вакцини для профілактики вірусу папіломи людини

Library of National Technical University "Kharkiv Polytechnic Institute"

ХІІІ Міжнародна науково-практична конференція магістрантів та аспірантів 
 
Матеріали конференції, 2019. 437 
УДК УДК 60-7, 606  
 
УДОСКОНАЛЕННЯ БІОТЕХНОЛОГІЧНОЇ СХЕМИ ВИРОБНИЦТВА 
РЕКОМБІНАНТНОЇ ВАКЦИНИ ДЛЯ ПРОФІЛАКТИКИ ВІРУСУ 
ПАПІЛОМИ ЛЮДИНИ 
 
Ю.О. ЗАГАЙНОВА
1*
,  І.А. БЄЛИХ
2 
 
1магістрант кафедри біотехнології, біофізики та аналітичної хімії, НТУ «ХПІ», 
Харків, Україна 
2доцент кафедри біотехнології, біофізики та аналітичної хімії, кандидат біологічних 
наук, НТУ «ХПІ», Харків, Україна 
*
email: yul.taranenko@gmail.com 
 
Рак шийки матки на сьогодні є однією з найбільш розповсюджених 
злоякісних пухлин у жінок. В Україні частота захворювання становить близько 
9 тисяч випадків на 100 тисяч населення. Причиною онкологічних захворювань, 
зокрема раку шийки матки є вірус папіломи людини (ВПЛ) [1].  
ВПЛ – це віруси, що викликають папіломи, кондиломи, дисплазію, рак 
шийки матки або передракові патологічні стани [1].  
Зараз в Україні використовуються дві вакцини проти ВПЛ типу 16 та 18, 
які пройшли всі клінічні випробування і довели свою ефективність. Вважається, 
вакцини більш дієві, якщо вакцинація проводиться до впливу ВПЛ (найкраще 
до першого сексуального контакту). Ці вакцини не лікують ВПЛ або хвороби 
пов’язані з ВПЛ, але використовуються в профілактичних цілях і дозволяють 
запобігти розвитку онкологічних захворювань [1].  
Вакцина для профілактики ВПЛ – рекомбінантна, виготовлена з 
високоочищених неінфекційних вірусоподібних часток основного білка L1 
оболонки ВПЛ 16 і 18 типів. Вірусоподібні частки не містять вірусної ДНК, 
тому вони не можуть інфікувати клітини, але вони викликають імунну 
відповідь та формують клітинну імунну пам’ять[1, 2].  
Метою дослідження є удосконалення біотехнологічної схеми виробництва 
вакцини проти ВПЛ.   
Для отримання рекомбінантних білків HPV представлені приклади 
використання дріжджів Saccharomyces cerevsiae, які є міжнародно визнаними 
безпечними та здатними до вироблення великої кількості білка в нативній 
конформації. Проте недоліком є нестабільність рекомбінантних клітин, що 
пов’язана з відносно високою частотою втрат автономної плазміди при поділі 
клітин. Також відоме отримання рекомбінантних білків HPV з використанням 
рекомбінантних штамів-продуцентів білка HPV16-L1 Pichia angusta BKMY-
2988D та HPV18-L1 Pichia angusta Y-2989D. Ці штами мають високу 
продуктивність, але не забезпечують отримання оптимального антигену. 
Можливе одержання вакцини проти ВПЛ з використанням дріжджів Hansenula 
polymorpha. Перевагою даного штаму є можливість отримання стабільно 
високого рівня синтезу цільового білка без порушення ефективності його 
ХІІІ Міжнародна науково-практична конференція магістрантів та аспірантів 
 
Матеріали конференції, 2019 438 
укладки. Використання експресійних касет з двома різними промоторами 
(MOX та DAK) забезпечує велику рівномірність синтезу продукту в процесі 
культивування [2].   
Білки HPV16-L1 та білки HPV18-L1 отримують окремо, в 2 біореакторах. 
Отримують плазмідний вектор paM547, що містить рекомбінантний ген 
DAK-HPV16-L1 і селективний маркер ген LEU2 Saccharomyces cerevsiae [2]. 
Фрагмент ДНК DAK-HPV16 і препарат плазміди гідролізують 
рестриктазами BsrGl і Hindlll. Отримані препарати фрагменту ДНК з 
рекомбінантним геном і плазміду вносять в реакційну суміш для проведення 
«зшивання». Після інкубації з Т4 лігазою протягом 2 годин, 2 мкл реакційної 
суміші використали для трансформації штаму Escherichia coli. З декількох 
трансформатів виділили плазмідну ДНК. На основі рестрикційного аналізу 
відбирають плазміду з фрагментом DAK-HPV16[2].  
Аналогічно отримують плазмідний вектор pKAM539A, що містить 
рекомбінантний ген MOX-HPV16-L1 і неповний ген – селективний маркер 
TRP3 Hansenula polymorpha [2]. 
Здійснюють культивування рекомбінантних клітин Hansenula polymorpha, 
що містять дві експресійні касети (одна з промотором МОХ, ін. – з DAK) в два 
етапи. На першому етапі при температурі 30°С нарощують біомассу в 
культуральному середовищі, що складається з 4 % дріжджового екстракту, 2 % 
бактопептону і 4 % гліцерину. Приблизно через 28–32 години ферментації 
додають індуктор до концентрації 0,5–0,8 % і підтримують на цьому рівня  
48–72 години [2].  
Після ферментації рекомбінантних клітин білок HPV16-L1 та білок 
HPV18-L1 виділяють згідно з методикою. Клітини з культуральної рідини 
осаджують центрифугуванням при 4000 g протягом 15 хвилин при 4°С. Для 
видалення основної маси нецільових білків і виділення антигену отриманий 
екстракт насичують сульфатом амонію до 45 % і далі осаджені білки 
центрифугують при 1200 g протягом 30 хвилин. Фракції, які містили антиген, 
концентрують ультрафільтрацією, розділяють за допомогою зонального 
центрифугування та очищають за допомогою гель фільтрації. Чистоту 
отриманого таким чином білка визначають методом електрофорезу [2].   
Одним з найбільш ефективних є біотехнологічне одержання за допомогою 
штаму дріжджів Hansenula polymorpha. Це обмежений вид дріжджів, які 
використовують метанол та Карбон в якості єдиного джерела енергії [2]. 
Перевагами даної технології є [1]: отримання вакцини з підвищеною 
імуногенністю; можливість контролювати відсутність мутацій в експресованих 
генах; зниження енерго- та капіталовитрат [1]. 
 
Список літератури: 
1. Тараненко Ю.О. Біотехнологія виробництва рекомбінантних вакцин проти вірусу 
папіломи людини: дипл. проект / Ю.О. Тараненко.  – Харків, 2018. –  66 с. 
2. Патент RU2546243С1. Рекомбинантная вакцина для профилактики папилломавирус-
ной инфекции человека и способ ее получения / М.А. Крымский, И.А. Борисов, 
М.С. Яковлев, М.О. Агафонов, М.Д. Тер-Аванесян. Заявл. 13.02.2014. Опубл. 10.04.2015. 


http://repository.kpi.kharkov.ua/bitstream/KhPI-Press/44461/1/Zahainova_Udoskonalennia_2019.pdf

Удосконалення біотехнологічної схеми виробництва рекомбінантної вакцини для профілактики вірусу папіломи людини

Abstract

Similar works

Full text

Available Versions

eNTUKhPIIR Electronic National Technical University "Kharkiv Polytechnic Institute"; Institutional Repository

Library of National Technical University "Kharkiv Polytechnic Institute"